杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用。所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。所述杨梅素抗甲型流感病毒中的作用机制是通过与PB2cap蛋白的结合抑制核糖核蛋白复合物vRNP活性，制备用于预防和治疗流感的药物。其中，杨梅素与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸(His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)，429位的天冬酰胺(Asn429)。

The application of myricetin in the preparation of anti influenza virus drugs

The invention discloses the application of myricetin in the preparation of anti influenza virus drugs. The influenza virus is a influenza A virus, which is preferred to be H1N1, H3N2, H5N1, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2 or H10N8. The action mechanism of myricetin on influenza A virus is to inhibit the activity of ribonuclein complex vRNP through binding with PB2cap protein, and to prepare drugs for prevention and treatment of influenza. Among them, myricetin and influenza virus PB2cap protein binding sites for 357 histidine (His357), 404 (Phe404), phenylalanine 323 phenylalanine (Phe323), glutamate 361 bit (Glu361), lysine 376 (Lys376), the 363 phenylalanine (Phe363), ASN 429 bit (Asn429).

【技术实现步骤摘要】
杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用
本专利技术涉及杨梅素在抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药

技术介绍
流感病一直是人们关注的焦点，尤其是甲型流感病毒所引起的疫情严重威胁着人类的健康。历史上甲型流感病毒引起的流感大爆发已有数次，自1918-1919年爆发的“西班牙流感”席卷了世界各地，造成了上千万人的死亡病例，随后又爆发的“亚洲流感”、“香港流感”、“墨西哥流感”。由于甲型流感病毒的抗原易转变和漂移，流感的防治形势依然不容乐观。目前，流感的防治策略主要是流感疫苗的接种和抗流感药物的使用，虽然接种疫苗是抗甲型流感病毒最有效的途径之一，但在应对新出现的流感病毒株时，疫苗的研究和使用总滞后0.5～1年。科研人员目前也致力于通用疫苗的研究，但尚处于临床试验阶段，而且是否能应对新的流感病毒株仍有存疑。因此，抗甲型流感病毒药物的研究是最有效的措施。临床上使用的抗流感药物可分为三类，经典的两类抗流感病毒药物：神经氨酸酶(NA)抑制剂和M2离子通道抑制剂，由于药物的耐药性和副作用限制了它们的使用。第三类是广谱的RNA聚合酶抑制剂，包括利巴韦林及法匹拉韦，目前未被广泛使用。由此可见，因此，急需寻找新的药物靶点，研究不同于现有药物作用机制的新型抗流感药物，对于流感的防治具有重要的意义。甲型流感病毒属正粘科单股负链RNA病毒，由八个全基因组构成，至少编码13种以上蛋白，包括编码蛋白和非编码蛋白。由于甲型流感病毒的表面抗原易发生漂移和转变，人们将抗流感病毒药物的研究聚焦在可选位点多且不易突变的RNA聚合酶上。流感病毒的RNA聚合酶是由PA、PB1、PB2三个亚基构成，各自发挥着不同的功能。尤其PB2亚基上存在一个独立折叠的“帽子”(cap)结构域，其作用是在病毒进入宿主细胞后，利用这个帽子结构抢夺宿主的mRNA，用于流感病毒本身的转录起始。因此，PB2cap结构可作为潜在的药物靶点进行研究，从该靶点寻找新型抗流感病毒药物，可从源头上阻断病毒的复制。我国物产资源丰富，对传统中药的使用由来已久，从天然单体中寻找低毒有效的抗流感病毒小分子化合物能有效的解决抗流感药物使用紧张的局势，也可为抗流感病毒药物的进一步研究奠定基础。杨梅素，是一类广泛存在于双子叶的黄酮类化合物，具有多重生物活性，在护肝、抗氧化、免疫调节、肿瘤、抗菌以及抗病毒等方面已有一定的研究进展，但在抗流感病毒方面的应用尚未见报道。本专利技术首次发现杨梅素具有抗甲型流感病毒的活性，能特异性地破坏PB2cap和宿主细胞帽状结构的相互结合，影响流感病毒的复制。不仅如此，杨梅素还具有一定抗炎作用，可以减少流感病毒感染导致的组织损伤，其有望成为一种新型的流感病毒先导化合物进行研发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于从天然产物中发现一种新型的抗流感病毒抑制剂。所述的杨梅素，具有显著的抗甲型流感病毒的活性，可以作为新的抗流感病毒药物和先导化合物进行开发，具有广泛的应用前景。所述杨梅素可抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2在宿主细胞中的复制。所述杨梅素能够靶向流感病毒的PB2cap蛋白，从而抑制其与宿主细胞帽状结构的结合以及vRNP的活性，具有明显的抗病毒活性，可用于制备成新型的抗流感病毒药物。所述杨梅素与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸(His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)，429位的天冬酰胺(Asn429)，可抑制vRNP活性与病毒复制，从而发挥抗病毒作用。所述杨梅素可制成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。综上所述，本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果：1.杨梅素均能抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。2.杨梅素对细胞的毒性较小，对MDCK细胞和A549细胞的CC50分别是749.4±12.3、355.3±7.2μM。杨梅素对甲型流感病毒H1N1和H3N2的IC50分为9.82±1.81，17.44±4.44μM，安全指数分别是76.3和43.4，可作为安全有效的抗流感病毒药物进行开发。3.杨梅素作用于流感病毒PB2蛋白的帽子结合区域，能竞争性抑制PB2蛋白与宿主mRNA5’端帽状结构的结合，阻止病毒的转录复制。附图说明图1杨梅素细胞毒性的检测。A.杨梅素对MDCK细胞的毒性；B.杨梅素对A549细胞的毒性。图2杨梅素抗甲型流感病毒的活性。A.杨梅素对不同甲型流感病毒株的抑制活性；B.杨梅素抑制甲型流感病毒引起的细胞病变；C.杨梅素抑制甲型流感病毒引起的空斑形成。图3杨梅素抑制流感病毒在细胞中的复制。A.杨梅素抑制流感病毒在MDCK细胞中NP蛋白的表达；B.杨梅素抑制流感病毒在MDCK细胞中NP蛋白的表达；C.杨梅素降低病毒在MDCK细胞中NPmRNA的表达水平。图4杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。图5杨梅素作用于流感病毒感染后阶段。图6杨梅素抑制流感病毒的前期复制。图7杨梅素能与PB2cap蛋白浓度依赖性结合。A.FP实验证明杨梅素能够与PB2cap蛋白浓度依赖性结合；C.SPR实验证明杨梅素与PB2cap蛋白有结合作用。图8杨梅素对流感病毒vRNP的活性的影响。图9杨梅素与PB2cap蛋白的分子对接。具体实施方式为了更好地理解本专利技术的内容，下面结合实验和结果对杨梅素在抗甲型流感病毒中的应用进一步说明。本专利技术所用的材料1细胞与病毒犬肾上皮细胞(MDCK细胞)、人肺癌上皮细胞(A549)和293T细胞在含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM或1640培养基进行培养。甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、H1N1FM-1和A/Aichi/2/68(H3N2)选择8-9天的鸡胚传代扩增，-80℃保存。质粒A/Thailand/Kan353/2004-HA、A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc用于H5N1假病毒的制备。其中pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并插入荧光素酶报告基因的一个重组质粒。pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP和pPolI-Flu以及hRluc-TK用于mini-replicon试验，其中pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP在细胞转染后形成RNP复合物。其中所有与活病毒相关试验是在生物安全2级或3级设施中进行。实施例1杨梅素对细胞毒性的检测杨梅素对细胞毒性的检测采用MTT法，从而确定药物的作用浓度。具体方法如下:MDCK或A549细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层，用不含血清的DMEM或1640梯度稀释杨梅素后加入到96孔板中，每孔200μl，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/mlMTT的1640或DMEM培养基，37℃孵育4h。采用多功能酶标仪(GeniosPro,Tecan,US本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式I所示化合物在制备抗流感病毒药物中的应用

【技术特征摘要】
1.一种式I所示化合物在制备抗流感病毒药物中的应用2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型流感病毒。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨洁，刘叔文，刘淼淼，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44