定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，从而具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

An ELISA kit for quantitative detection of insect resistant protein Vip3Aa20 in transgenic maize and its detection methods

The present invention discloses insecticidal protein Vip3Aa20 quantitative detection of transgenic maize in the ELISA kit and detection method, the ELISA kit was captured by the package antibody microporous reaction plate, liquid sample, biotinylated detection antibody, standard, horseradish peroxidase labeled streptavidin and biotin labeled antibody dilution, horseradish peroxidase labeled avidin diluted and concentrated washing solution, substrate solution and stop solution and plate paste composition, which has the advantages of simple operation, rapid detection of a large number of samples at the same time, it has the characteristics of high sensitivity and high specificity.

【技术实现步骤摘要】
定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及到定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
技术介绍
苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在营养生长期分泌具有高抗虫活性的可溶蛋白(VegetativeInsecticidalProteins,Vipproteins)。在接种15个小时至产孢期，菌液上清均可检测到Vip3蛋白的表达。抗虫蛋白Vip3对鳞翅类(Lepidoptera)昆虫有广泛毒性，当昆虫取食Vip3蛋白后，该蛋白经中肠蛋白酶活化，活化的蛋白穿透围食膜，与中肠细胞的上皮细胞顶膜特异蛋白结合并形成肠穿孔，从而破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，最终导致死亡。因此Vip3基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最具有潜力和应用前景的抗虫基因。其中Vip3Aa基因已成功的被用于转基因棉花和玉米。但是在转基因作物的飞速发展在带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题，越来越多的国家要求对转基因产品进行检测以实行标识制度。目前在检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒方面，美国envirologix只有定性检测试剂盒，国内外尚未有定量检测试剂盒的报道。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。为实现上述目的，本专利技术提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。其中，样品处理液的配方为：生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的Vip3Aa201F9-1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；标准品：2ng的His-Vip3Aa20重组蛋白(冻干粉)，所述His-Vip3Aa20重组蛋白是通过将Vip3Aa20编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-vip3Aa20转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Vip3Aa20表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到；辣根过氧化物酶标记的亲和素：1:40辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)标记的亲和素(avidin)母溶液(金开瑞公司)，工作液以1:100倍稀释；生物素标记的抗体稀释液/辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方：浓缩洗涤液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；底物溶液：0.5mL2mg/mLTMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL30％H2O2混合，现用现配；终止液：1MH2SO4。所述试剂盒的特性：1)灵敏度为：10.242pg/mL2)精密度：批内差CV％<8％，批间差CV％<10％3)特异性：本试剂盒特异性检测vip3A，且与其他相关蛋白无交叉反应。上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCCNo.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7分泌得到的，上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，捕获抗体检测范围：0.03125ng/mL-2ng/mL。上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述检测抗体由保藏号为CGMCCNo.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5分泌得到。所述的杂交瘤细胞株2G3-1D7和1F9-1F5是用原核表达的重组蛋白Vip3Aa20免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。本专利技术还提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)将上述样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟；2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干后加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，混匀在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度OD值；3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。上述检测方法在另一种实施方式中，生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体液用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。浓缩洗涤液：洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶；洗液工作液：将浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240mL去离子水，倒入浓烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。上述检测方法在另一种实施方式中，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本80-120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5-2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2-4次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液80-100μL，37℃避光显色15-30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液的配方为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油 2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Vip3Aa20 1F9‑1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；标准品为2ng的His‑Vip3Aa20重组蛋白；辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA 1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN3 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；浓缩洗涤液为含有1.0％Tween‑20的10×PBS；底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；终止液为1M H2SO4。...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液的配方为：1MTris,pH7.5500uL，1MNaCL1.5mL，0.5MEDTA20uL，50％甘油2mL，10％SDS1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Vip3Aa201F9-1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；标准品为2ng的His-Vip3Aa20重组蛋白；辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA1g，0.05％的吐温200.05mL，0.1％的NaN30.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；底物溶液为0.5mL2mg/mLTMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL30％H2O2混合，现用现配；终止液为1MH2SO4。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCCNo.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7分泌得到的。3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，捕获抗体的检测范围0.03125ng/mL-2ng/mL。4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由保藏号为CGMCCNo.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5分泌得到。5.一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将权利要求1所述的样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟；2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干后加入生物素标记的检测抗体工作液进...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫晓，李亮，金芜军，宛煜嵩，黄卫红，苗朝华，高进，董美，王迪，胡晓颖，安娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11