The invention discloses a method for solid-phase competition ELISA detection kit Seneca virus antibody and its application. The kit comprises a Seneca inactivated virus antigen coated ELISA plate and HRP labeled Rabbit anti IgG virus seneca. The invention uses HRP to mark Rabbit anti IgG, instead of one anti and two resistance in the traditional ELISA, and simplifies the operation step. At the same time by changing the coating process stable inactivated SVV antigen coated to the surface of a solid phase carrier, preparation process change enzyme antibody dilution, the enzyme labeled antibody working fluid storage without changing its activity and potency, established agent box and detecting method for specific detection of SVV antibody solid-phase competition ELISA test. The present invention makes up for the detection of SVV ELISA antibody vacancies, overcome the existing VNT detection of SVV antibody detection in repeatability and low sensitivity, operating procedures cumbersome, provides an effective technical means for the detection of SVV antibody.
【技术实现步骤摘要】
一种用于塞内卡病毒抗体检测的固相竞争ELISA试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒及其应用,特别涉及基于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)特异性酶标抗体技术建立SVV固相竞争ELISA抗体检测试剂盒及其应用。本专利技术属于生物检测
技术介绍
SVV也被称为塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV),其对美国猪群来说并不陌生。在过去30年中,共有近20例SVV感染被确认。在美国,SVV通常与特发性猪水疱病有关。在全球范围内都有SVA的报道,包括加拿大、澳大利亚、意大利、新西兰和巴西。SVV是一种无囊膜、单链RNA病毒,与猪口蹄疫(FMD)和猪水疱病毒一样,属小RNA病毒科。它可能是猪特发性水疱病的病原体,但是这种观点尚未得到证实。2015年9月,美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡,PCR检测排除FMDV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A/B/C型猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)的感染,发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为SVV阳性,并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到SVV。2015年3月,我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行,将发情母猪赶去配种舍定位栏冲洗干净后,发现一头猪出现鼻镜水泡,送检水泡液、水泡皮、脚皮样品,检测结果显示口蹄疫、猪水疱病病原检测均阴性而猪场的发病仍在扩大,最终通过对病料进行多种病原的检测送测序后获得一段序列,经与基因数据库比对,发现与SVV序列的相似性最高,继而查找资料,确定发病猪群 ...
【技术保护点】
一种用于塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗体检测的固相竞争ELISA试剂盒,其特征在于包括塞内卡病毒灭活抗原包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。
【技术特征摘要】
1.一种用于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)抗体检测的固相竞争ELISA试剂盒,其特征在于包括塞内卡病毒灭活抗原包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的酶标板按照以下方法制备得到:(1)SVV灭活抗原的包被将108.50TCID50/ml的SVV灭活抗原用pH7.2的碳酸盐缓冲液进行1:20的稀释,之后在ELISA板的每孔加50μl抗原稀释液,4℃静置8~12小时;(2)酶标反应板稳定剂的配制将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖,加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解,加0.05w/v%Procline300,保存于4℃备用;(3)酶标反应板的封闭方法弃去酶标板孔内的抗原稀释液,加入洗涤液,室温下振荡洗涤2分钟,甩掉洗涤液,用吸水纸吸干并驱除孔内气泡,同法重复洗涤3次,甩干酶标板;之后按150μl/孔的量加入步骤(2)制备得到的酶标反应板稳定剂,4℃过夜,弃去稳定剂,拍干并置通风厨中吹干酶标板,用铝箔袋加入干燥剂真空包装,4℃保存备用。3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到:(1)获得SVV高免兔血清;(2)离心去除SVV高免血清的沉淀,之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v%的硫酸葡聚糖溶液,室温搅拌15分钟,12000r/min,4℃离心20分钟,收集上清液;(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液,混匀后于4℃静置4~6小时,离心弃上清,用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀,透析去除硫酸铵;(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L,pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱,然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品,再以5~10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤,最后用2~5倍柱体积的0.1M,pH2.7的Glycine-HCl洗脱,收集洗脱液,4℃透析浓缩,得到高纯度SVV兔抗IgG;(5)HRP标记SVV兔抗IgG的制备将纯化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中,轻轻吹打混匀,4℃过夜;向混合物中加入40μL的三乙醇胺,混匀,加入50μL的硼氢化钠,混匀,4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液,混匀,...
【专利技术属性】
技术研发人员:郑海学,田宏,杨帆,石正旺,刘华南,张克山,朱紫祥,李丹,曹伟军,刘永杰,
申请(专利权)人:中国农业科学院兰州兽医研究所,
类型:发明
国别省市:甘肃,62
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