本发明专利技术公开了一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，其利用Alphascreen实验初步选出11个小分子抑制剂和一个小分子促进剂，这12种药物都是临床用药。在细胞水平上对这12种药物进一步筛选，空斑实验证实GSK J4HCL明显抑制了弓形虫的增殖并通过胞内增殖实验确定了它对弓形虫的EC50值在4.5μM左右。AlphaScreen竞争性抑制实验评估GSK J4HCL抑制TgAtg8‑TgAtg3相互作用的IC50值为11.01μM。利用CCK8实验证明了该药抑制宿主细胞生长的IC50值为34.359μM，远大于该药对虫体的EC50值，说明GSK J4HCL是一个低毒且高效的抗弓形虫药物。
【技术实现步骤摘要】
一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法
本专利技术属于生物医药
，尤其是一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选及应用方法。
技术介绍
目前，弓形虫(Toxoplasmagondii)是专性寄生于几乎所有有核细胞内的一种重要的人畜共患病原。当感染人群免疫力低下时，虫体可诱发炎症反应，严重可致死亡。妇女孕期首次感染可发生流产、死胎或畸型等。畜牧动物感染弓形虫易出现流产、肉/奶品质量下降，给畜牧业带来巨大经济损失。此外，弓形虫感染的动物食/制品是该病重要传播途径。随着我国人群饮食习惯的改变、饲养宠物人数增多以及“二胎政策”的全面放开，弓形虫病的防控在公共卫生和畜牧生产上均有重要意义。目前治疗和预防弓形虫的药物主要是乙胺嘧啶和磺胺嘧啶，然而，这些药物都有副作用如:中性粒细胞减少、血小板严重下降、白细胞减少、血清肌酐和血清肝酶升高、超敏反应等。另外，临床上治疗弓形虫的其他药物如阿奇霉素，克拉霉素、螺旋霉素、阿霉素等耐受性差且对缓殖子没有作用。在法国的临床试验中，有24％的血清阳性的怀孕女性是采用螺旋霉素、甲氧嘧啶和磺胺多辛联合用药来保护婴儿不被弓形虫感染。在怀孕早期，螺旋霉素单一疗法可以有效预防产前传播。然而超过50％的螺旋霉素患者在血液中仍然存在弓形虫DNA。因此，寻找一种高效、低毒药物是弓形虫病防治工作中亟需解决的问题。本专利技术在前期研究中(陈弟，林佳鑫，刘阳阳，李相志，陈高帜，聂琴琴，华倩倩，胡昕和谭峰；2016；弓形虫TgAtg8-TgAtg3相互作用的鉴定；热带医学学报v.153,p.79-85；(Chen,D.,J.Lin,Y.Liu,X.Li,G.Chen,Q.Hua,Q.Nie,X.Hu,andF.Tan,2016,IdentificationofTgAtg8-TgAtg3interactioninToxoplasmagondii:ActaTrop,v.153,p.79-85.))证实弓形虫自噬相关蛋白(T.gondiiautophagy-relatedprotein,TgAtg)8与TgAtg3之间存在特异的蛋白相互作用关系。以此为靶点，筛选获得一个小分子药物，发现其既可显著抑制虫体增殖、延长弓形虫感染小鼠的存活时间，而且对宿主无明显毒副作用。上述结果提示：TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用是一个具有潜在应用前景、特异性较高的药物靶点。然而，由于该小分子药物来源局限、成本过高、无自主知识产权等缺陷，并不适合作为后续研究与药物研发。药物研发是一个周期长、投入费用高的系统工程。相比新药研发，采用“老药新用”策略可以缩短研发周期、降低研发成本，同时具有副作用小等优点。例如：利用抗疟疾药物氯奎宁抑制癌症的侵袭转移、用于风湿性关节炎药物“金诺芬(Auranofin)”的抗溶组织内阿米巴的效力是甲硝唑的十倍多。目前，获美国食品药品管理局(FDA)批准、可用于临床治疗的共1751个小分子药物，而抗弓形虫药物应满足膜通透性好、特异性高、对宿主细胞毒性小的优点。小分子药物主要是合成药物，通常指分子量小于1000的有机化合物。在常用药物数据库中，小分子药物的数量占到了98％，而生物技术药物只占2％。它进入细胞，与特定的生物分子(即靶标)相结合，通过靶标影响整个细胞及组织的功能，起到特定的治疗或预防作用，具有使用广泛、理论成熟等优势。小分子药物结构稳定，可通过直接口服达到预期的疗效，在临床应用上具有使用方便，药效持久等优势。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，该方法可以筛选出高效、低毒抗弓形虫的药物，其作为小分子抑制剂能够有效抑制弓形虫的生长，具有应用于治疗刚地弓形虫病的前景。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，步骤如下：(1)纯化HIS-TgAtg3蛋白选取正确的菌株(陈弟，林佳鑫，刘阳阳，李相志，陈高帜，聂琴琴，华倩倩，胡昕和谭峰；2016；弓形虫TgAtg8-TgAtg3相互作用的鉴定；热带医学学报v.153,p.79-85；(Chen,D.,J.Lin,Y.Liu,X.Li,G.Chen,Q.Hua,Q.Nie,X.Hu,andF.Tan,2016,IdentificationofTgAtg8-TgAtg3interactioninToxoplasmagondii:ActaTrop,v.153,p.79-85.))大量诱导表达，收集菌体，100mL菌液沉淀重悬于10mLPBS缓冲液中，冰浴超声裂解，8000rpm，4℃离心10min收集上清液；1)取上清液10mL样品用0.45μM滤菌器过滤备用；2)混匀质量浓度为50％的NI-NTA，吸取4mL的质量浓度为50％的NI-NTA，置于底部有盖子的专用蛋白纯化管中，移去盖子，待完全沉淀，先用10mL灭菌水洗，流速靠重力作用；3)柱子预平衡:用2mL的pH＝7.4的磷酸缓冲液缓冲液(PBS)进行平衡30min，流速靠重力作用；4)将准备好的10mL样品上样，靠重力作用使重组蛋白His-TgAtg3与镍柱结合；5)用8mL洗脱缓冲液洗柱子，洗脱缓冲液包括pH＝7.4的磷酸缓冲液和500mM的咪唑，并将洗脱缓冲液设置不同梯度备用；6)最后用最高浓度洗脱缓冲液将全部蛋白洗脱，取少量洗脱缓冲液做SDS-PAGE蛋白电泳检测；7)纯化完毕后用平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％量的乙醇，封好加样口，柱子存放4℃备用；8)用透析法将无机盐离子与目的蛋白分离，①透析袋的处理选取截留分子量大小合适的透析袋，并剪成合适的长度，用含0.372g/LEDTA、20g/LNaHCO3的处理液煮沸15min，缓慢冷却后无菌水洗3次，降温备用；②透析将蛋白装入透析袋内，用无菌水作为交换液，将容器置于磁力搅拌器上，4℃搅拌透析过夜；9)BCA法测定蛋白浓度根据待测样品数量，配制适量的BCA工作液，BCA工作液包括BCA试剂A和BCA试剂B(试剂A为BCA碱性溶液，试剂B为硫酸铜溶液；其作用是BCA碱性溶液与二价铜离子的硫酸铜溶液组成的试剂，在其混合后显示苹果绿色，在碱性溶液与蛋白质结合时，蛋白质将二价铜离子还原为一价铜离子，一个一价铜离子螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物)，两者的体积比为50：1，充分混匀，将标准蛋白稀释为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的浓度梯度，将稀释的标准蛋白加至96孔板中，每孔20μL；待测样品用PBS缓冲液稀释后加至96孔板中，每孔20μL；每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪检测562nm吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。(1)纯化GST-TgAtg8蛋白37℃过夜培养GST-TgAtg8蛋白后，按照1:100重新接种于新的LB液体培养液中扩大培养，加IPTG诱导剂诱导4小时，收集诱导的菌液沉淀，加入PMSF超声离心后，留取蛋白上清液，0.45μM过滤器过滤后，冰上备用；1)将Glutathione-SepharoseTM4B介质充分混匀后，取适量加入到放了一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，步骤如下：(1)纯化HIS‑TgAtg3蛋白选取正确的菌株大量诱导表达，收集菌体，100mL菌液沉淀重悬于10mL PBS缓冲液中，冰浴超声裂解，8000rpm，4℃离心10min收集上清液；1)取上清液10mL样品用0.45μM滤菌器过滤备用；2)混匀质量浓度为50％的NI‑NTA，吸取4mL的质量浓度为50％的NI‑NTA，置于底部有盖子的专用蛋白纯化管中，移去盖子，待完全沉淀，先用10mL灭菌水洗，流速靠重力作用；3)柱子预平衡:用2mL的pH＝7.4的磷酸缓冲液缓冲液(PBS)进行平衡30min，流速靠重力作用；4)将准备好的10mL样品上样，靠重力作用使重组蛋白His‑TgAtg3与镍柱结合；5)用8mL洗脱缓冲液洗柱子，洗脱缓冲液包括pH＝7.4的磷酸缓冲液和500mM的咪唑，并将洗脱缓冲液设置不同梯度备用；6)最后用最高浓度洗脱缓冲液将全部蛋白洗脱，取少量洗脱缓冲液做SDS‑PAGE蛋白电泳检测；7)纯化完毕后用平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％量的乙醇，封好加样口，柱子存放4℃备用；8)用透析法将无机盐离子与目的蛋白分离，①透析袋的处理选取截留分子量大小合适的透析袋，并剪成合适的长度，用含0.372g/L EDTA、20g/L NaHCO3的处理液煮沸15min，缓慢冷却后无菌水洗3次，降温备用；②透析将蛋白装入透析袋内，用无菌水作为交换液，将容器置于磁力搅拌器上，4℃搅拌透析过夜；9)BCA法测定蛋白浓度根据待测样品数量，配制适量的BCA工作液，BCA工作液包括BCA试剂A和BCA试剂B，两者的体积比为50：1，充分混匀，将标准蛋白稀释为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的浓度梯度，将稀释的标准蛋白加至96孔板中，每孔20μL；待测样品用PBS缓冲液稀释后加至96孔板中，每孔20μL；每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪检测562nm吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白37℃过夜培养GST‑TgAtg8蛋白后，按照1:100重新接种于新的LB液体培养液中扩大培养，加IPTG诱导剂诱导4小时，收集诱导的菌液沉淀，加入PMSF超声离心后，留取蛋白上清液，0.45μM过滤器过滤后，冰上备用；1)将Glutathione‑Sepharose TM4B介质充分混匀后，取适量加入到放了一片筛板的层析柱中，介质用量根据蛋白产量决定，其最大载量为8mg/mL His标记蛋白介质；2)用5倍柱体积自备去离子水洗柱，共三次；3)用5倍柱体积的新配PBS洗柱，共三次；4)将上述步骤(2)纯化GST‑TgAtg8蛋白中的备用蛋白上清液加入纯化介质，4℃结合1小时；5)用10倍柱体积的新配PBS洗柱，将未结合的杂蛋白洗去，收集并保存穿透液；6)用已配置的洗脱缓进一步冲液洗柱，收集并保存穿透液；7)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存下次使用；(3)Alphascreen小分子抑制剂筛选实验，生物素标记GST‑TgATG8蛋白后，与HIS‑TgAtg3蛋白及筛选的临床治疗的共1751个小分子药物按照预设的比例共同室温孵育1小时；再将Alphascreen受体磁珠和供体磁珠依次加入蛋白混合物中，在室温中孵育1小时；读板后分析数据；利用Alphascreen筛选出18个小分子抑制剂和一个小分子促进剂；(4)SPR竞争性抑制实验同Alphascreen竞争性抑制实验，纯化GST‑TgAtg8及HIS‑TgAtg3蛋白后，将DMSO溶液以及筛选出的18个小分子抑制剂和1个小分子促进剂分别加入原核表达的TgAtg8‑TgAtg3反应体系中，实时动态监测各小分子药物对TgAtg8‑TgAtg3的阻断作用，利用SPR实验进行反筛查，最终筛选出12个小分子抑制剂和一个小分子促进剂。...
【技术特征摘要】
1.一种能够抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂的筛选方法，步骤如下：(1)纯化HIS-TgAtg3蛋白选取正确的菌株大量诱导表达，收集菌体，100mL菌液沉淀重悬于10mLPBS缓冲液中，冰浴超声裂解，8000rpm，4℃离心10min收集上清液；1)取上清液10mL样品用0.45μM滤菌器过滤备用；2)混匀质量浓度为50％的NI-NTA，吸取4mL的质量浓度为50％的NI-NTA，置于底部有盖子的专用蛋白纯化管中，移去盖子，待完全沉淀，先用10mL灭菌水洗，流速靠重力作用；3)柱子预平衡:用2mL的pH＝7.4的磷酸缓冲液缓冲液(PBS)进行平衡30min，流速靠重力作用；4)将准备好的10mL样品上样，靠重力作用使重组蛋白His-TgAtg3与镍柱结合；5)用8mL洗脱缓冲液洗柱子，洗脱缓冲液包括pH＝7.4的磷酸缓冲液和500mM的咪唑，并将洗脱缓冲液设置不同梯度备用；6)最后用最高浓度洗脱缓冲液将全部蛋白洗脱，取少量洗脱缓冲液做SDS-PAGE蛋白电泳检测；7)纯化完毕后用平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％量的乙醇，封好加样口，柱子存放4℃备用；8)用透析法将无机盐离子与目的蛋白分离，①透析袋的处理选取截留分子量大小合适的透析袋，并剪成合适的长度，用含0.372g/LEDTA、20g/LNaHCO3的处理液煮沸15min，缓慢冷却后无菌水洗3次，降温备用；②透析将蛋白装入透析袋内，用无菌水作为交换液，将容器置于磁力搅拌器上，4℃搅拌透析过夜；9)BCA法测定蛋白浓度根据待测样品数量，配制适量的BCA工作液，BCA工作液包括BCA试剂A和BCA试剂B，两者的体积比为50：1，充分混匀，将标准蛋白稀释为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的浓度梯度，将稀释的标准蛋白加至96孔板中，每孔20μL；待测样品用PBS缓冲液稀释后加至96孔板中，每孔20μL；每孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪检测562nm吸光度值，根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。(2)纯化GST-TgAtg8蛋白37℃过夜培养GST-TgAtg8蛋白后，按照1:100重新接种于新的LB液体培养液中扩大培养，加IPTG诱导剂诱导4小时，收集诱导的菌液沉淀，加入PMSF超声离心后，留取蛋白上清液，0.45μM过滤器过滤后，冰上备用；1)将Glutathione-SepharoseTM4B介质充分混匀后，取适量加入到放了一片筛板的层析柱中，介质用量根据蛋白产量决定，其最大载量为8mg/mLHis标记蛋白介质；2)用5倍柱体积自备去离子水洗柱，共三次；3)用5倍柱体积的新配PBS洗柱，共三次；4)将上述步骤(2)纯化GST-TgAtg8蛋白中的备用蛋白上清液加入纯化介质，4℃结合1小时；5)用10倍柱体积的新配PBS洗柱，将未结合的杂蛋白洗去，收集并保存穿透液；6)用已配置的洗脱缓进一步冲液洗柱，收集并保存穿透液；7)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡，最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存下次使用；(3)Alphascreen小分子抑制剂筛选实验，生物素标记GST-TgATG8蛋白后，与HIS-TgAtg3蛋白及筛选的临床治疗的共1751个小分子药物按照预设的比例共同室温孵育1小时；再将Alphascreen受体磁珠和供体磁珠依次加入蛋白混合物中，在室温中孵育1小时；读板后分析数据；利用Alphascreen筛选出18个小分子抑制剂和一个小分子促进剂；(4)SPR竞争性抑制实验同Alphascreen竞争性抑制实验，纯化GST-TgAtg8及HIS-TgAtg3蛋白后，将DMSO溶液以及筛选出的18个小分子抑制剂和1个小分子促进剂分别加入原核表达的TgAtg8-TgAtg3反应体系中，实时动态监测各小分子药物对TgAtg8-TgAtg...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑贤，谭峰，张芳菲，华倩倩，曹佳欣，王炎，胡昕，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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