一种固定化酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种吸附—覆膜联合固定化酶的制备方法，其制备包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得吸附—覆膜联合固定化酶。本发明专利技术吸附、覆膜过程条件温和，酶活回收率高，固定化酶的稳定性高，操作简单、成本低。

A preparation method of immobilized enzyme

The invention discloses a preparation method of adsorption film combined with immobilized enzyme and its preparation method includes the following steps: (1) the enzyme dissolved in buffer solution made of enzyme solution and mixed with adsorption material, oscillating adsorption time, leaching, adsorption of immobilized enzyme; (2) film the protective agent dissolved in buffer solution made of protective agent, the adsorption of immobilized enzyme in protective agent solution, oscillation for a time filter, drain, adsorption of immobilized enzyme protective agent treated; (3) the covering material made by dissolving the coated solution in a solvent, immobilized enzyme and mixed solution film the adsorption will protect the treated film, oscillation of certain time, filter out drying; (4) finally, using deionized water or buffer flushing after adsorption film combined with immobilized enzyme. The process of adsorption and film mulching of the invention is mild, the recovery rate of enzyme activity is high, the stability of the immobilized enzyme is high, the operation is simple and the cost is low.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种固定化酶的制备方法。
技术介绍
近些年来，以基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程为代表的现代生物技术发展迅猛，并日益影响和改变着人们的生产和生活方式。酶工程是生物技术的重要组成部分，是利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶作为一种生物催化剂，其催化反应具有高效性、选择性、专一性，且反应条件温和，在制药、食品、环保、酿造、能源等诸多领域都得到了广泛的应用。但是，大多数酶的化学本质为蛋白质，因而酶在游离状态使用时容易受到不利反应环境条件(如高温、高压、强酸、强碱、重金属离子、有机溶剂等)的影响导致结构变化降低活性甚至失活。此外，游离酶使用时与底物、产物混合在一起，反应结束后不易回收，也给产物分离纯化造成困难。这些都大大限制了酶在众多工业生物催化领域中的应用。酶的固定化是用固定化材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶的研究始于1910年，正式研究于20世纪60年代，70年代已在全世界普遍开展。当前固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法，前者是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法，后者是将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中使酶固定化的方法。物理法固定化酶的优点在于固定化条件温和，酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留，酶活回收率高。但是，吸附法酶和载体之间的结合力比较弱，酶很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物；包埋法容易出现酶的渗漏和底物产物扩散限制等问题。化学法是通过载体表面的活性功能基团和酶分子上的非必需基团形成化学共价键，或利用一些多功能交联试剂如戊二醛，在酶分子间或酶分子和载体分子间形成化学共价键，从而实现酶与载体不可逆结合的酶固定化方法。化学法固定化酶具有结合牢固，稳定性高的优点，但固定化过程反应比较激烈，容易造成酶的失活，酶活回收率低。随着固定化酶技术研究的不断深入，很多新的固定化手段不断涌现，但是都是上述方法的改进或组合，仍然难以兼顾高的酶活回收率和高的稳定性。因此，开发新的酶固定化方法依然是酶工程的重要研究内容之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种吸附—覆膜联合固定化酶的制备方法，该固定化酶制备方法简单，固定化酶活回收率高、稳定性高、重复使用性能好。本专利技术提供的一种吸附—覆膜联合固定化酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得吸附—覆膜联合固定化酶。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(1)所述的酶为水解酶类(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶等等)、氧化还原酶类(如漆酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、脂肪酸氧化酶、酮还原酶、醇脱氢酶等等)、转移酶类(如甲基转移酶、氨基转移酶、酰基转移酶等等)、裂合酶类(如脱水酶、脱羧酶、碳酸酐酶、醛缩酶等等)、异构酶类(如异构酶、表构酶、消旋酶等等)、合成酶类(如谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶、羧化酶、磷酸化酶等等)中的一种或多种，优选地，为一种，或多种具有协同作用的酶，或多种可催化级联反应的酶。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(1)所述的吸附材料为凹凸棒土、硅藻土、高岭土、膨润土、活性白土、沸石、蒙脱石、膨胀珍珠岩、生物陶粒、粗孔微球硅胶、多孔硅胶珠、活性炭、活性氧化铝、火山岩滤料、介孔材料、大孔树脂、玉米芯中的一种或多种，优选地，为一种，或多种外观形态一致的吸附材料。吸附材料类别、颗粒大小根据待固定化酶应用领域、应用工艺灵活选择。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(1)中酶溶液中酶蛋白与吸附材料的比例为3-300mg/g，单位mg/g中的mg指酶蛋白的质量，g指吸附材料的质量，优选地，根据吸附材料的不同，酶蛋白的投量为吸附材料最大吸附量的30％以下。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(2)所述的覆膜保护剂为甘油、山梨醇、木糖醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、脱脂乳中的一种或多种；覆膜保护剂的浓度为0.25～15％(w/v)，优选地为0.5～6.0％(w/v)；吸附固定化酶与覆膜保护剂溶液的比例为0.05-0.5g/mL，单位g/mL中的g指吸附固定化酶的质量，mL指覆膜保护剂溶液的体积。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(3)所述的覆膜材料为聚乙烯醇类、卡波姆以及醋酸纤维素、二醋酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素等纤维素衍生物，优选地，固定化酶应用于水相催化，使用醋酸纤维素、二醋酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素等水不溶性纤维素类衍生物作为覆膜材料；固定化酶应用于非水相催化，使用聚乙烯醇类、卡波姆作为覆膜材料。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(3)所述的覆膜材料溶剂为水、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、吡啶、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲乙酮，优选地，聚乙烯醇类、卡波姆的溶剂为水，纤维素类的溶剂为丙酮、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、吡啶、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲乙酮中的一种或多种。覆膜材料溶于溶剂制成的覆膜溶液浓度为0.1～3.0％(w/v)，优选地为0.25～1.5％(w/v)。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(3)所述的保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合的比例为0.05-0.5g/mL，单位g/mL中的g指保护剂处理过的吸附固定化酶的质量，mL指覆膜溶液的体积。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(1)、(3)和(4)所述的缓冲液为10～200mmoL/LpH2.0～10.0的缓冲液，优选地，适合待固定化的酶的最适pH缓冲液。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(1)、(2)、(3)中振荡吸附、振荡处理、振荡覆膜的温度为4～35℃，优选地为15～25℃，振荡转速为50～300rpm，优选地为100～200rpm，振荡吸附时间为2～24小时，优选地为6～12小时，振荡处理的时间为2～24小时，优选地为4～8小时，振荡覆膜的时间为2～60分钟，优选地为5～20分钟。根据本专利技术所述的固定化酶制备方法，步骤(3)中覆膜后的固定化酶干燥温度为0～40℃，优选地为4～10℃，干燥时间为0～24小时，优选地为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得到吸附—覆膜联合固定化酶。

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得到吸附—覆膜联合固定化酶。2.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的酶为水解酶类(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶等等)、氧化还原酶类(如漆酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脂肪酸氧化酶、酮还原酶、醇脱氢酶等等)、转移酶类(如甲基转移酶、氨基转移酶、酰基转移酶等等)、裂合酶类(如脱水酶、脱羧酶、碳酸酐酶、醛缩酶等等)、异构酶类(如异构酶、表构酶、消旋酶等等)、合成酶类(如谷氨酰胺合成酶、DNA连接酶、羧化酶、磷酸化酶等等)中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的吸附材料为凹凸棒土、硅藻土、高岭土、膨润土、活性白土、沸石、蒙脱石、膨胀珍珠岩、生物陶粒、粗孔微球硅胶、多孔硅胶珠、活性炭、活性氧化铝、火山岩滤料、介孔材料、大孔树脂、玉米芯中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中酶溶液中酶蛋白与吸附材料的比例为3-300mg/g，单位mg/g中的mg指酶蛋白的质量，g指吸附材料的质量。5.根据权利要求1所述的一种固定...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏二正，杨猛，孙伊伊，陈龙，
申请(专利权)人：宁夏乙征生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64