重组毕赤酵母的高密度发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开一种重组毕赤酵母高密度发酵工艺，特别是采用全自动控制发酵罐进行发酵的工艺。本发明专利技术的工艺方法是将工作种子接种于ＢＳＭ培养基中，培养温度为２８℃，并进行搅拌，加氨水或磷酸控制发酵体系的ｐＨ值为４．８，罐压为０．８个大气压，当发酵罐中的甘油耗尽后一次缓慢加入甘油溶液２８０ｍｌ，待甘油再次彻底耗尽后，分五次缓慢加入每升含ＰＴＭ↓［１］１２ｍｌ的甲醇溶液进行甲醇诱导，诱导７２小时后结束发酵。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及改进的一种重组毕赤酵母高密度发酵工艺，特别是采用全自动 控制发酵罐进行发酵的工艺。本专利技术的实施例中特别给出一种猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-TSOL18的高密度发酵方法。
技术介绍
毕赤酵母作为一类单细胞真核生物，有完整的亚细胞结构和控制严密的基 因表达调控机制，既能通过有丝分裂进行无性繁殖，也可以通过减数分裂实行 有性繁殖。作为一种微生物，具有生长繁殖迅速、营养要求简单和便于工业化 大规模发酵培养的优点。用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降 低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋 白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加 稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表 达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此 很容易通过离心将含目的蛋白质的上清与酵母细胞加以分离，大大简化了目的 蛋白的纯化过程。毕赤酵母表达体系的显著特点就是表达菌株很容易从摇瓶水平按比例放大 到高细胞密度的发酵罐培养基中。在进行小量表达时，常用摇瓶培养，由于培 养液的酸碱度、培养物的通气不足、碳源最适添加量以及甲醇浓度等影响酵母 表达的关键因素均无法控制，大大影响了外源蛋白的表达水平。如用全自动控 制发酵罐进行高密度发酵培养，通过不断摸索、筛选，确定重组酵母高密度发 酵的最佳条件，就可以使外源蛋白在发酵罐中的表达水平比普通摇瓶提高10 ioo倍，完全可以满足大规模生产的需要。如在酵母表达载体上醇氧化酶基因强 启动子的作用，破伤风毒素蛋白的产量可达12g/L。随着巴斯德毕赤酵母表达系 统的不断发展和日趋完善，必将有许多具有商业价值的外源蛋白在此系统中得 到成功的表达。"猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组基因工程疫苗的研制".(袁改玲.中国农业科 学院博士学位论文.2005:19.)以及"猪囊尾蚴疫苗候选基因TSOl8在酵母中的高 效表达".(袁改玲,才学鹏,景志忠，郑亚东,骆学农,贾万忠,李辉,丁军涛.生物工程 报.2005,21(4):563-567.)公开发酵表达的方法是采用YPD为培养基进行二级种子培养，体系的pH值为5，再将得到的二级种子液接种于BSM培养基中进行发酵培 养，当甘油消耗尽后以lml/min的速度在发酵体系中加入每升含12mlPTM!的甘油 溶液6小时，在甘油再次耗尽后分三次补加甲醇，进行甲醇诱导表达，三次加入 甲醇的速率及加入的时间分别为第一次0.115ml/min,共4小时；第二次0.23ml /min，共4小时；第三次0.345ml/min 64小时。最终得到产物中蛋白产量为2.54g/L。
技术实现思路
本专利技术提供一种可比现有技术有更高蛋白产表达量的重组毕赤酵母的高密 度发酵工艺，特别是本专利技术提供一种可以更高效制备猪带绦虫六钩呦TSOL18重 组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-TSOL18的高密度发酵方法。本专利技术的重组毕赤酵母的高密度发酵工艺方法是将工作种子接种于BSM培 养基中，培养温度为28。C，并进行搅拌，加氨水或磷酸控制发酵体系的pH值为 4.8,罐压为0.8个大气压，校正溶氧DO达100y。，当发酵罐中的甘油耗尽后一次 缓慢加入每升含12mlPTM,的甘油溶液280ml，待甘油再次彻底耗尽后，分五次 缓慢加入每升含PT!V^12ml的甲醇溶液进行甲醇诱导，首次加入甲醇溶液30ml， 第二次加入甲醇溶液60ml，当甲醇耗尽后，再次加入甲醇溶液360ml，诱导表达 24小时后，第四次加入甲醇溶液360ml，诱导12小时后，最后一次加入甲醇溶液 1296ml， 36小时后结束发酵。本专利技术的重组毕赤酵母的高密度发酵工艺中最佳的工艺条件为甘油溶液的加入流速是0.67ml/min，甲醇诱导时甲醇加入流速分别为第一次和第二次为 一次性加入；第三次为0.25ml/min;第四次为0.5ml/min;第五次为0.6ml/min。本专利技术的的重组毕赤酵母的高密度发酵工艺方法中，其工作种子采用如下 措施制备先挑取1个重组单克隆菌落到一级种子YPD培养基中培养菌体浓度 OD,达到6.0，得到一级种子培养液；再将上述培养液倒入含有体积比为50%的 BSM发酵罐培养基的YPD 二级种子培养基中培养菌体浓度OD6oo达到40.0，即 得发酵工作种子液。 '本专利技术的实施例中所用的重组毕赤酵母为猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组毕 赤酵母。经相关的试验与对比可见，本专利技术的方法效率更高，可比现有技术有更高 的蛋白表达量。 附图说明图l为采用本专利技术的方法制备二级种子，即向二级种子培养基中加入50%的基础培养基BSM和现有技术制备二级种子的方法(即，不加基础培养基仅为 YPD的工作种子)在发酵增菌阶段的菌体生长比较图，其中带有小方格的曲线 为本专利技术测试曲线，带有小棱形格的曲线为现有技术实测曲线。图2为采用猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-TSOL18的高密度发酵方法所生产的发酵液上清SDS-PAGE电泳图，其中泳道1 为蛋白Marker，泳道2为表达产物。 具体实施例方式以下为本专利技术的实施例，实施例中的重组毕赤酵母为猪带绦虫六钩蚴 TSOL18重组巴斯德毕赤酵母GS 115/pPIC9K-TSOL 18 。巴斯德毕赤酵母(P/c/2/a/ osto^) GS115/pPIC9K-TSOL18构建方法如下将pGEM-TSOLl8和表达载体pPIC9K分别用EcoR I和五coR I、 I进行双酶 切，回收目产物用T4DNAligase连接，获得表达载体pPIC9K-TSOL18，将其转 化大肠杆菌JM109，挑单克隆，鉴定出阳性质粒。将pPIC9K-TSOL18用1单酶切线性化后，与毕赤酵母感受态细胞混匀 进行电转化，转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置2『C恒温培养2-4天， 能在MD培养基上生长的菌落为His+转化子。将MD培养基平皿中长出的最初 His+转化子，影印法依次接种到含G418浓度梯度为1.0、 2.0mg/mL的YPD培 养基中，筛选出多拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-TSOL 18 。1. 工作种子培养从划线的YPD平板(G418浓度为2mg/mL)上挑取1个单克隆菌落到一 级种子YPD培养基(200ml三角瓶装20mlYPD)中培养24小时左右至菌体浓 度OD,达到6.0，得到一级种子培养液；再将上述培养液倒入含有体积比为50% 发酵罐培养基(BSM)的YPD 二级种子培养基(2000ml三角瓶装200ml混合 培养液)中培养18小时左右至菌体浓度OD6oo达到40.0，即得发酵工作种子液。2. 接种前准备洗净发酵罐，用pH7.0和pH4.0标准液校正发酵罐的pH计探头，然后将已配制 好的发酵罐培养基(BSM)倒入发酵罐中，12rC高压灭菌20min，高压过程中 校正溶解氧DO为0。/。，冷却后接好其他附属设备。3. 接种灭菌结束待冷却到28。C后，在火焰圈的保护下加入消泡剂和浓度为12ml/L 的PTI^8.7ml，然后以10。/。的接种量将发酵工作种子液接种于5L全自动控制发酵罐中，装液量为本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组毕赤酵母的高密度发酵方法，其特征是工作种子接种于ＢＳＭ培养基中，培养温度为２８℃，并进行搅拌，流加氨水或磷酸控制发酵体系的ｐＨ值为４．８，罐压为０．８个大气压，校正溶氧ＤＯ达１００％，当发酵罐中的甘油耗尽后一次缓慢加入每升含１２ｍｌＰＴＭ↓［１］的甘油溶液２８０ｍｌ，待甘油再次彻底耗尽后，分五次缓慢加入每升含ＰＴＭ↓［１］１２ｍｌ的甲醇溶液进行甲醇诱导，首次加入甲醇溶液３０ｍｌ，第二次加入甲醇溶液６０ｍｌ，当甲醇耗尽后，再次加入甲醇溶液３６０ｍｌ，诱导表达２４小时后，第四次加入甲醇溶液３６０ｍｌ，诱导１２小时后，最后一次加入甲醇溶液１２９６ｍｌ，３６小时后结束发酵。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：才学鹏，侯俊玲，王颖，骆学农，丁军涛，张少华，郑亚东，赵松波，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]