一种基因打靶定点转基因方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种基因打靶定点转基因方法及其应用，该方法以目标基因家族的间隔ＤＮＡ序列为靶位点，以其两侧序列为同源重组引导序列构建基因打靶载体，通过基因打靶获得目的基因定点整合且稳定表达的转基因细胞、转基因生物个体。本发明专利技术的方法可用于通过动植物生物反应器、细胞或微生物来生产目的蛋白质和ＲＮＡ产品，也可用于改良生物个体的性状、基因治疗人类疾病等。本发明专利技术的靶位点设计在转录活跃的基因组区域，为外源基因提供一个开放和活跃的转录环境，克服位置效应的影响，外源基因稳定表达、稳定遗传；靶位点一般在基因间的间隔序列，克服了毒性整合的安全性问题；靶位点为重复序列，将基因定点整合的效率提高了数百倍以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基因打靶定点转基因方法及其应用。
技术介绍
自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，获得 了个体比对照组大一倍的转基因"超级小鼠"以来，转基因这项高新技术受到 各国重视，发展迅速，取得不少突破。转基因猪、兔、牛、羊和鱼等相继问世， 全世界巳申请的工程动物专利达到八十多项。为培养生产性状优良的超级种 群、制备髙增值的蛋白和激素类特效药物以及按人的需求提供理想的实验动物 等方面开辟了新途径。因此，转基因方法的研究无论对于基因调控的理论研究， 还是获得具有经济价值的转基因动植物都具有重耍的意义。然而，现有转基因方法存在一些缺陷，其主要问题是由于外源基因是通过 各种载体或其他方法将外源基因导入靶细胞,然后让外源基因及载体序列随机 整合到染色体的基因组上。随机整合的外源基因往往是优先插入基因位点，从 而破坏细胞生命活动的相关基因甚至使细胞恶变(毒性整合)。随机整合也可 能因位置效应使外源基因表达不稳定或失活；为达到细胞内环境的自身平衡， 随机整合外源基因的细胞可能改变其染色质的髙级结构，使外源基因隐藏在染 色质髙级结构的内部而失活(沉默整合)。因此，随机插入的转基因方法严重 阻碍了外源基因在转基因动植物内的有效整合和稳定遗传及表达,利用随机整 合获得稳定表达外源基因的转基因动植物的效率极低。为了避免上述缺陷，使外源基因整合到染色体基因组的特定位点是问题的关键，能使基因定点整合的 基因打靶技术是解决该问题的一种理想方法。基因打靶技术是一种通过同源重组的方法定向改变生物活体遗传信息的 实验手段。基因打靶已经被证明是目前精确地修饰基因组的最有效方法之一。 目前基因打靶技术主要应用于基因功能的研究、研制人类疾病动物模型、改良 动物品种和研制动物反应器。为了将外源基因整合在基因组中的特定位置，从 而避免毒性整合和沉默整合,有人尝试采用基因打耙的基因敲入技术解决这些问题。2000年，McCreath等成功地利用基因打耙技术在绵羊胎儿成纤维细胞 中将a抗胰蛋白酶(AAT)基因定点整合入绵羊al原胶原(COL1A1)基因 位点，并通过核移植技术获得了一只活的绵羊，外源基因在乳汁中的含量达 0.65mg/ml。 (Mc Creath KL， et al. Production of gene-targeted ship by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature, 2000， 405(6790): 1066-1069)。 2003 年，李宁等得到了我国首批通过基因打靶获得的转基因克隆牛(龚国春，李宁 等，利用体细胞核移植技术生产转基因牛.科学通报，2003， 48(24):2528-2533)。 这些基因打靶技术虽然克服了随机整合的一 些问题，但是基因打靶技术仍 然存在一些不足之处(l)由于外源基因整合位点常常不在转录活跃区域，很多基因打靶的敲入基因表达量低且不稳定。(2)通常基因打靶敲入霈要置换体 内一些原有的基因，这破坏了细胞原有的内环境平衡；(3)基因打耙的基因敲 入技术利用的同源重组靶位点通常为单拷贝序列，与打耙载体发生同源重组的 概率极低，即定点整合效率太低。其中，基因打耙技术存在的另--关键问题在 于靶位点通常为单拷贝序列，而基因之间的间隔DNA重复序列被认为是外源 基因整合的禁区，原因是DNA重复序列处通常无基因表达。然而，rRNA等基因家族的间隔DNA序列完全能表达(Sylvester JE， et al. The human ribosomal RNA genes: structure and oiganization of the complete repeating unite. Hum Genet, 1986,3:193-198)。目前尚未见有关以基因家族的间隔DNA序列为粑位点的基 因打靶定点转基因技术的报道。
技术实现思路
木专利技术的目的是针对现有技术中存在的不足，提供'1巾以基因家族的间隔 DNA序列为靶位点的，适用亍各种生物和细胞、农达稳定且安全高效的基因 打耙定点转基因方法。本专利技术的另一个目的是提供上述方法在生产目的蛋白质、RNA产品、改 良生物个体性状、基因治疗疾病及其他转基因领域中的应用。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的本专利技术采用一种以基因家族的间隔DNA序列为耙位点的定点转基因方 法，即基因打耙的定点整合技术，如利用rRNA基因家族的间隔DNA序列作 为靶位点和同揮重组引导序列进行定点转基因。所有生物的细胞存在rRNA基 因家族，动物细胞由18S、 5.8S、 28S rRNA基因及其基因间的内部转录序列(rrs)串联成一个转录单位。每个细胞的基因组中均有100-300个拷贝的转录单位；不同个体、同一个体的不同组织细胞甚至同种细胞的不同代谢时期， 其rRNA拷贝数或表达水平不一致。因此，在3种rRNA基因间的ITS定点插 入外源基因时，外源基因整合到某个转录活跃的基因组区域，可以为外源基因 的表达提供一个开放和活跃的转录环境，克服位置效应的影响，外源基因稳定 表达、稳定遗传，避免基因沉默；ITS为非基因的间隔序列，不会改变rRNA 表达水平而影响细胞的功能，避免了细胞内环境平衡的破坏及基因失活。此外，每个真核细胞的基因组中均有100-300个拷贝的转录单位，增加了基因定点整 合的潜在靶位点，将基因定点整合的效率提髙了数百倍。本专利技术选择以基因家族的间隔DNA序列为靶位点，以其两侧序列为同源 重组引导序列构建基闲打靶载体，通过基闵打靶^得目的基因定点整合且稳定 农达的转基因细胞、定点转基因生物。本专利技术的基闲打靶转基冈方法，其具体操作歩骤如h(1) 克隆生物基因组中目标基因家族的间隔DNA序列，寻找合适的靶位点；(2) 以上述间隔DNA序列为靶位点，以粑位点两侧的DNA序列为左、 右同源重组引导序列；用该左、右同源重组引导序列、目的基因及其表达框架 和(或)正负筛选基因等元件构建基因打耙载体；将基因打靶载体导入体细胞、 生殖细胞、干细胞、微生物等受体细胞，通过基因定点整合检测获得定点转基 因细胞；(3) 筛选获得表达目的基因的定点转基因细胞；(4) 将上述定点转基因细胞通过各种繁育方法产生定点转基因生物个体;(5) 筛选^得表达目的基因的定点转基因生物个体。上述步骤(1)中，基因家族的间隔DNA序列包括生物基因组中的低度 重复序列、中度重复序列、髙度重复序列、低拷贝序列，包括基因间的转录活 跃序列和非转录序列，如各种生物的rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、 珠蛋白基因、免疫球蛋白基因等基因家族的间隔DNA序列，其GenBank号为 AY452489、 AY452490、 AY452491 、 AY452492'、 AY452493 、 AY452494、 AY452495、 AY779625、 AY779626、 AY779627、 AY779628、 AY779629、DQ018752、 DQ018753、 DQ018754、 DQ018755、 DQ018756。在进行本专利技术的基因打粑定点转基因操作屮，首先克隆生物中的rRNA基 因、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因打靶定点转基因方法，其特征在于该方法是以生物基因组中目标基因家族的间隔ＤＮＡ序列为靶位点，通过基因打靶进行定点转基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐冬生，
申请(专利权)人：唐冬生，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]