一种检测发酵蔬菜中原核微生物多样性的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测发酵蔬菜中微生物多样性的方法，本发明专利技术方法直接从样品中抽取所含微生物的总ＤＮＡ，通过对１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的序列分析，从而确定样品中微生物的种类。本发明专利技术方法由于直接从样品中提取ＤＮＡ，中间没有任何筛选性的过程，因此，所得ＤＮＡ能够准确地反映发酵蔬菜中微生物种类，避免了培养分离方法不能真实反映发酵蔬菜体系微生态实际情况的缺点，并能够对发酵蔬菜中某一微生物在发酵蔬菜体系中的相对含量作出评估。由于本发明专利技术方法不需要将菌种进行分离，因而可以大大缩短了检测时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测技术，具体地说是一种应用分子手段检 测发酵蔬菜中原核微生物多样性的方法。
技术介绍
蔬菜发酵体系是一种独特的微生态环境。其中的微生物(原核 微生物)与发酵蔬菜制品的品质和风味有直接的关系，对发酵蔬菜 中微生物的多样性及其所扮演角色进行调查研究为改进传统蔬菜发 酵工艺、探究发酵菜风味形成机理等方面提供可供参考的数据。据 资料报道，前人用微生物培养方法和非培养方法(分析脂肪酸的方 法)对发酵蔬菜中乳酸菌作系统分类法的 研究。微生物的培养分离方法是在人工配制的培养基上接入发酵蔬 菜水样品，以一定的培养条件下培养发酵蔬菜水中微生物的方法， 这种方法由于使用的培养基和培养条件和发酵蔬菜体系中营养、环 境条件不完全相同，不可避免地会造成菌株的富集和衰退，这就人 为改变了原始发酵蔬菜体系中菌群的微生态构成，会对研究结果造 成较大的偏差。可能在发酵蔬菜体系中占主要地位或含量很高的菌 群在培养基中无法培养或生长很差。反而用培养分离法从发酵蔬菜 中分离出的优势的菌种经研究后却发现这些细菌仅仅是由于培养基 上能大量被培养出来，从而被高估了它们的实际含量和作用。另外，自然界中有相当的菌种(约有90%-99%)用培养基无法培养出来。 因此用培养分离的方法反映发酵蔬菜体系中微生物种类和实际存在 的微生物存在很大偏差。并且用微生物培养方法需要时间长，步骤 繁瑣。用脂肪酸组成非培养方法分析发酵蔬菜体系中微生物多样性时鉴定区分关系较远的微生物有一定困难，其应用受到限制；碳源利用分析方法主要基于革兰氏阴性菌的鉴定，不能真实反应发酵蔬 菜体系中大量微生物。而用本专利技术的分子生物学手段能够快捷、准 确的反映发酵蔬菜中微生物多样性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足提供一种检测发酵蔬菜中微生 物多样性的新方法，该方法避开了微生物培养分离环节，釆取直接从样品中抽取所含微生物总DNA进行分析，了解其中所包含的微生 物DNA的种类，并且还可以估算各种微生物的相对含量。本专利技术方法包括如下步骤从样品中抽取所含微生物总DNA， 以总DNA为模板，以16SrRNA基因通用引物为引物扩增16S rRNA 基因，回收扩增产物并建立16SrRNA基因的克隆菌库，测定阳性克 隆16SrRNA基因的序列，与基因数据库比较后确定其身份。本专利技术的样品可以是发酵液。所使用的通用引物可以是大肠杆 菌16SrRNA上的一段。并且可以根据所要具体扩增的产物类型进一 步确定引物序列。建立克隆菌库可以釆用常规的方法，将扩增产物 回收，并和T载体连接后导入感受态大肠杆菌中，经选择性培养得 到了 16S rRNA基因的克隆菌库。在测序前可以对阳性克隆菌用PCR 法进一步确认，然后再送交测序公司测序可降低成本。并且可以通过计算某一阳性克隆菌占总阳性克隆菌的比例确定 该菌在发酵蔬菜体系中的相对含量。本专利技术方法由于直接从样品中提取DNA，中间没有任何筛选性 的过程，因此，所得DNA能够准确地反映发酵蔬菜中微生物种类， 避免了培养分离方法不能真实反映发酵蔬菜体系微生态实际情况的 缺点，并能够对发酵蔬菜中某一微生物在发酵蔬菜体系中的含量作 出评估。由于本专利技术方法不需要将菌种进行分离，因而可以大大缩 短了检测时间。附图说明4图l是釆用常规方法的鉴定程序。 具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一 步说明，但不用来限制本专利技术的 范围。实施例l用16SrRNA基因检测泡菜水中乳酸菌的种类及含量取四川泡菜水IO毫升，用灭菌的滤纸过滤，用细菌基因组DNA 提取试剂盒(天根时代公司)提取发酵蔬菜滤液中微生物总DNA,以此DNA为模板，以 细菌16SrRNA基因通用引物为引物进行PCR扩增，上下游引物分 别为fD 1: 5 '國AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTC AG-3' rDl: 5'國AAGGAGGTGATCCAGCC-3'扩增条件反应体系和反应条件分别见表1和表2。表1 PCR反应体系 Tab.l Reaction system of PCR<table>table see original document page 5</column></row><table>表2PCR反应条件<table>table see original document page 5</column></row><table>再延伸72 C10min回收扩增产物并与T载体连接，将连接产物导入感受态大肠杆 菌ToPlO,用选择培养基培养，筛选阳性克隆(含有目的片断连接 产物的菌落)，用PCR方法进一步确认阳性克隆，将阳性克隆测序， 将测序结果分别在GenBank库中比对，结果发现在本例中共有8种 乳酸菌。见表3。表3发酵菜商中乳酸菌的16S rDNA序列分析结果Organism identified No. (%) of Unique clone designation GenBank accession % Similarity'鉴定的微生物 organism 不同微生物的编号 number 同源性(％)identified GenBank登录号相对含量(％)丄a加6ocz7/ws aciaf的r/wfle 14 (25.46)BH> B3, B16， B26， B20， B21， DQ649012 B5， B29， B30， B35， B4， B8， B36, B4097.9 98.7丄(3加6aa7/w51 p/。她n/w 20 (36.36)B19， B25, B2， B6， B10， B13， DQ 64卯13 B27， B34, B14， Bl, B7， B18， B24, B15， B38， B39， B23， B4l， B42，B12,B2898,1 99.03(5.46)B44 ， B46DQ64901598.1~99.14(7.27) 5(9.01)6(10.91)2(3.64)1(1.81)B50， B17， B6， B9 DQ649014 B22， B43， B51， B53， B55 EF423913B31， B32， B37， B45， B47，B48 EF423914B49， B52B54EF423911EF42390898.5 99.2 98.6 99.998.6-99.098.3 99.2*克隆菌16S rRNA基因序列同GenBank库中比对后的同源程度 用常规方法检测发酵蔬菜体系中乳酸菌多样性的方法步骤:1.发酵菜卤中乳酸菌的分离分离乳酸菌是用MRS和M17培养基。MRS琼脂用于分离乳酸 杆菌，明串珠菌和足球菌属的乳酸菌。M17用于分离乳球菌属和肠 球菌。将发酵菜卤稀释(105、 106、 10。后接种的MRS, M17平板 在3(TC厌氧培养48时。从不同的高浓度平板中随机挑取菌落转移到 装有无菌MRS和M17肉汤培养基的10ml试管中，进行种属鉴定之 前将分离的菌落在适宜的琼脂培养基上用连续划线方法纯化。共103 株纯化的菌。2发酵菜卣中乳酸菌的鉴定程序及实验项目鉴定程序可参照图l进行，实验项目包括1) 革兰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测发酵蔬菜中微生物多样性的方法，包括步骤：从样品中抽取所含微生物的总ＤＮＡ，以总ＤＮＡ为模板，以１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因通用引物为引物扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因，回收扩增产物并建立１６ＳｒＲＮＡ基因的克隆菌库，测定阳性克隆１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的序列，与基因数据库比较后确定其身份。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛文通，燕平梅，张惠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]