本发明专利技术公开了一种功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，涉及3对用于功能性微生物多样性分析的针对β-葡萄糖苷水解酶基因的引物。经DNAMAN6.0软件进行序列同源性比对后分别设计β-葡萄糖苷水解酶GH1家族的通用简并引物GH1F，GH1R，GH1R-GC，和β-葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物GH3BF，GH3BR，GH3BF-GC，以及β-葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物GH3EF，GH3ER，GH3EF-GC，本发明专利技术提供的引物具有很好的通用性和实用性，能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，具体地说，涉及功能性微生物多样性分析用针对β-葡萄糖苷水解酶基因的引物和使用所述引物的多重扩增。
技术介绍
β_葡萄糖苷水解酶是微生物降解纤维素反应中的限速酶，他作用于由葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶分解纤维素产生的纤维二糖分子和一些更小的寡聚糖分子，将其水解生成葡萄糖分子供微生物利用，因此β-葡萄糖苷水解酶在自然界碳循环中发挥着重要的作用。自然界中能产生葡萄糖苷水解酶的微生物种类繁多，不同微生物的葡萄糖苷水解酶按其分子结构特征分属为配糖水解酶家族I (GHl)和配糖水解酶家族3 (GH3)两类，同一家族中的葡聚糖苷酶基因同源性较高，这使葡萄糖苷水解酶基因具备了作为分子标记基因应用于复杂微生态环境中功能性微生物群落多样性的研究。本研究通过数据库获得不同微生物β-葡萄糖苷水解酶基因序列，经DNAMAN6. O软件进行序列同源性比对后分别设计β_葡萄糖苷水解酶GHl家族的通用简并引物，和β -葡萄糖苷水解酶GH3家族细菌、放线菌的通用简并引物，以及β -葡萄糖苷水解酶GH3家族真菌的通用简并引物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种功能性微生物多样性分析用引物和使用该引物的多重扩增，所述引物能良好的反应实验对象中参与降解纤维素的功能性微生物的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。其技术方案为一种功能性微生物多样性分析用引物，选择通用简并引物3对GH1F和GHlR-GC ；GH3BR 和 GH3BF-GC ；GH3ER 和 GH3EF-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GHlF和GH1R-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GH3BR和GH3BF-GC。进一步优选，所述通用简并引物为GH3ER和GH3EF-GC。一种多重扩增检测方法所述方法用于来源土壤，沉积物，人畜胃肠道的环境样品的分析，该方法包括本专利技术所述的引物进行扩增。具体方法如下β -葡萄糖苷水解酶GHl家族基因的PCR扩增(I)弓丨物选择通用简并引物GHlF和GHlR-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNA IOxPCRbufFer5μ dNTP4μ 模板Ιμ Taq 酶0.5pLGHlF0.5μ GHlR-GC0.5μ 加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反 应条件 94°C预变性3min 94°C 变性Imin47.3°C 退火Imin 72°C 延伸45 S 72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(细菌来源)基因的PCR扩增(I)引物选择通用简并引物GH3BR和GH3BF-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNA IOxPCR buffer5μ dNTP4μ 模板I μι Taq 酶0.5pL GH3BR0.5μ GH3BF-GC0.5μ 加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反应条件 94°C预变性3min 94°C 变性Imin 52°C 退火Imin72 延伸45S 72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。β -葡萄糖苷水解酶GH3家族(真菌来源)基因的PCR扩增(I)引物选择通用简并引物GH3ER和GH3EF-GC(2)反应体系及反应参数模板为纯化后的DNAIOxPCRbuffer5μ dNTP4μ 模板Ιμ Taq 酶0.5μιGH3ER0.5 μιGH3EF-GC0.5μ 加灭菌的去离子水补充反应体系，总体积为50 μ L(3)反应条件94°C预变性3min94°C 变性Imin57.2 °C 退火Imin72°C 延伸45 S72°C终延伸IOmin35个循环后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。样品DNA的提取改进的细菌基因组DNA的提取方法DNA 提取液的配制100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L EDTA，100mmol/L 磷酸钠，I. 5mol/LNaCl, 1% CTAB, pH8. 0(I)称取3g新鲜的堆肥样品，加入13. 5mLDNA提取液中；(2)加入50 μ L的蛋白酶K(20mg/mL)，于225r/min摇床上37°C摇动30min ;再加入I. 5mL的20% SDS，65°C水浴I. 5h，每隔10 20min颠倒混匀一次；(3)室温6，000r/min离心IOmin,收集上清转移到50mL离心管中，沉淀加入4. 5mL提取液和20%的SDS0. 5mL，涡旋震荡20s，65°C水浴IOmin ；(4)室温6，000r/min离心IOmin,收集上清合并于上次上清。重复上述操作，收集上清与前两次上清合并；(5)上清与等体积的氯仿异戍醇(24 I体积比)充分混合,6，000r/min离心IOmin,吸取上层水相转移至另一 50mL离心管中；(6)以0. 6倍体积的异丙醇室温沉淀Ih,室温16，000r/min离心15min,收集核酸沉淀；(7)用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，用200 μ L的TE溶解沉淀。真菌基因组DNA的提取(I)称取0. 5g玻璃珠放入I. 5mL的离心管中，加入0. 4g的样品，加入ImlBufferSLX/巯基乙醇。在漩涡震荡器上震荡5min ；(2)在70°C水浴中放置lOmin，每隔2 3min混匀一次。3000 5000r/min室温离心5min,转移800 μ L的上清液到一个新的2mL的离心管中,加入270 μ L的buffer SP2震荡30S混合均匀；(3)冰浴5min,在13000r/min4°C离心5min,转移上清到一个新的2mL的离心管中，加0. 7体积的异丙醇，充分混匀(来回颠倒离心管20次)，4°C 13000r/min离心IOmin用来沉淀DNA ；(4)小心弃掉上清，确定没有将DNA沉淀吸出，用滤纸将液体吸干，加200 μ LElutionBuffer至离心管中，震荡IOS后加入50 μ L的HTR Reagent (使用前要摇勻)，震荡混匀IOS ； (5)室温放置2min, 13000r/min离心2min ;转移上清至一新的I. 5mL的离心管中，加入等体积的XP2 Buffer，震荡混匀IOS ；(6)将上述离心管中液体的700 μ L放置到提供的HiBind DNA column中，室温10000r/min离心lmin，弃掉上清液，将柱子重新放回收集管中，重复一次后加300 μ L ΧΡ2Buffer,室温 10000r/min 离心 Imin ；(7)倒掉上清液，再将柱子放回新的收集管中，再用700 μ L用无水乙醇稀释过的SPffffash Buffer, 10000r/min 离心 lmin,倒掉上清液，重复再加 700 μ L 的 SPW Wash Buffer后离心；(8)弃掉液体将柱子放入一个空的收集管中13000r/min室温离心2min,这一步骤很重要，处理不当会影响下游操作；(9)将柱子放置到新的I. 5mL的离心管中，加入30 μ L的去离子，13000r/min离心Imin洗脱DNA，重复本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李洪涛，马波，刘华晶，许修宏，徐杰，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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