生物芯片检测中的分子放大制造技术

一种用于生物芯片检测的生物芯片杂交信号分子放大技术，主要是通过杂交前方法或杂交后方法将荧光微球特异地连接到ＤＮＡ芯片杂交的双链ＤＮＡ上，实现ＤＮＡ芯片杂交荧光信号分子放大，它大大地提高了ＤＮＡ芯片的检测的灵敏度，使生物芯片检测技术可以广泛地推广应用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物芯片(或称DNA芯片、基因芯片)，特别是一种在生物芯片检测过程中杂交信号分子放大技术。生物芯片是20世纪90年代的重大生物新技术，是微电子与生物技术的交叉成果。生物芯片的检测以物理学的荧光检测为主。至今已有两种类型1、点扫描的共聚焦(Confocal)型检测仪；2、基于电荷藕合检测器(CCD)的成像型检测仪，例如“SHLI Ⅱ型生物芯片检测仪。目前，应用DNA芯片来检测DNA样品是先将样品单链DNA用荧光标记，再将荧光标记的单链样品DNA加入到已经制作好的DNA芯片中，使它们充分相互接触反应即杂交反应。根据碱基配对原理，在一定的条件下，与DNA芯片上已知核苷酸阵列完全配对的荧光标记样品DNA就被固定在芯片一定的位置上，而不配对的单链样品DNA会被冲洗掉。通过Confocal检测芯片上荧光的位置和强度可获得样品DNA的生物信息。此方法的特点是可得到高清晰度的DNA芯片扫描图象，但其最大的不足是其昂贵的仪器价格，使它不能在研究所和医院中广泛推广，这就是前者的问题。后者较便宜，易于推广，但是对某些应用，灵敏度尚嫌不足，虽然对互补脱氧核糖核酸(cDNA)微阵列芯片灵敏度尚可，而对疾病诊断等DNA芯片则嫌不够。本专利技术的目的就是为了克服上述困难，利用价廉的生物芯片检测仪同样可获得高清晰度的DNA芯片杂交信号图象，提出了一种生物芯片杂交信号分子放大技术。本专利技术的实质就是把DNA杂交信号分子放大机制引入DNA芯片的检测系统中，并利用我们已申请的前专利“生物芯片检测仪”(专利申请号为99240088.0)进行检测，即可获得高清晰的DNA芯片杂交信号荧光图象。本专利技术的生物芯片杂交信号分子放大，包括将样品单链DNA加入到DNA芯片中进行杂交反应，清洗和检测，其特点是所说的样品单链DNA加入到DNA芯片中要通过杂交前方法或杂交后方法，将荧光微球特异地连接到DNA芯片上杂交的双链DAN上。生物分子荧光信号放大目前有三种方法可供选用，即生物素——亲和素系统、酶系统和荧光微球系统。在DNA芯片检测中较简单方便的是通过杂交前方法或杂交后方法将荧光微球特异性地连接到DNA芯片上杂交双链DNA上。所说的“杂交前”方法就是(1)先对样品单链DNA进行处理，使其带有活性基因。(2)与DNA芯片杂交。(3)清洗后再将带有活性基团的荧光微球与已杂交的DNA芯片上相对应的活性基团作用(生物素——亲和素相互作用、氨基与羧基以及醛基进行化学反应等)，从而将荧光微球连接到杂交的DNA双链上而完成DNA芯片杂交荧光信号的分子放大。所说的对样品单链DNA进行处理的方法已有很多成熟方法可供采用，包括生物素化、氨基化、或地高辛化等。例如生物素化的杂交前方法的步骤(1)先对样品单链DNA进行生物素化处理，使其带有生物素(活性基团)；(2)与DNA芯片杂交；(3)清洗；(4)将带有亲和素(活性基团)的荧光微球与已杂交的DNA芯片上相对对应的生物素(活性基团)作用，将荧光微球连接到DNA双链上。对样品单链的生物素化又有两种方法(1)酶法，可用末端转移酶经末端转移或DNA聚合酶经随机引物法或缺口平移法而生物素化。(2)化学法，如补骨脂素-生物素法、光生物素法等。利用已有的商业化补骨脂素-生物素试剂盒(补骨脂素-biotinlabelingkit)，可通过紫外照射将补骨脂素-生物素与样品单链DNA连接，或通过光生物素经可见光照射10分钟而生物素化。对样品单链DNA氨基化利用末端标记法将8-氨基己烷-三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸标记到DNA探针的3’末端，或通过对胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤溴化后再二氨基己烷替换而氨基化样品单链DNA。对样品单链DNA地高辛化的杂交前方法是(1)先对样品单链DNA进行地高辛化处理，(2)与DNA芯片杂交；(3)清洗；(4)将带有地高辛抗体的荧光微球连接到杂交的双链DNA上。所说的杂交后方法就是在杂交后利用特异性的DNA双链嵌入试剂嵌入到已杂交的DNA双链内，再利用嵌入试剂的活性基团与荧光微球上相对应的活性基团反应，实现杂交信号分子放大。所说的杂交后方法的步骤如下(1)样品单链DNA与DNA芯片杂交；(2)杂交后利用含有游离伯氨基的补骨脂素衍生物(例如4’-氨丁基4,5’,8-三甲基-补骨脂素)特异性地嵌入到已杂交的DNA双链内；(3)冲洗掉少量的与单链DNA非共价结合的补骨脂素衍生物；(4)用365纳米波长的紫外光照射后，补骨脂素衍生物可与DNA杂交双链形成牢固的共价链结合；(5)补骨脂素衍生物又可通过连接剂二硫双(N-羟基-琥珀酰亚胺丙酸)酯连接含有活性基团的荧光微球，或通过与N-羟基-琥珀酰亚胺氨基己酸酯连接的生物素共价交联后再与带亲和素的荧光微球连接，或直接与带有活性羧基的荧光微球连接。由于本专利技术将荧光微球特异性地连接到DNA芯片上已杂交的双链DNA上，荧光微球中连接有许许多多的荧光分子，也就是说，在这里，我们用一个荧光微球取代了传统方法中DNA芯片上的一个或几个荧光分子，增加了单位面积上的杂交双链的荧光分子数。这样，当用荧光微球标记杂交双链DNA分子时就达到了信号放大的作用，提高了检测灵敏度。同时，它也能够弥补杂交效率低等原因造成的对荧光检测灵敏度的影响，使得共聚焦显微镜等检测DNA芯片的技术更加完善。这种带荧光分子信号放大的DNA芯片检测技术不仅适用于低、中密度的DNA芯片的检测，也有望适用于高密度DNA芯片的检测。从而使其以价廉物美及高灵敏度的特点取代或部分取代目前共聚焦显微镜检测DNA芯片的技术。因此本专利技术具有广泛的使用价值。本专利技术与生物芯片检测仪联合应用，即可满足高分辨率和高灵敏的需要，又符合便宜实用的要求。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1——杂交前方法之一(样品单链DNA生物素化)的实验步骤(1)将样品单链DNA(探针)进行生物素化处理，使其带上生物素基团(生物素化包括酶法和化学法)。(2)将带有生物素标记的单链样品DNA与DNA芯片杂交，杂交后的DNA芯片与带有亲和素的荧光微球在含3％牛血清白蛋白的冲洗液中作用10-30分钟后，冲洗液冲洗3次，每次5分钟，吹干后检测。其中生物素冲洗液的配方是50mmol三羟甲基氨基甲烷(Tris),pH7.4；200mmol氯化钠；0.3％特威恩-20(去污剂Tween-20的商品名)；0.01硫硫汞。实施例2——杂交前方法之二(样品单链DNA氨基化)的实验步骤(1)通过末端标记法将DNA探针氨基化后，使其3’末端带上氨基，或通过溴化以及二氨基己烷替换方法氨基化探针。(2)将带有氨基标记的单链样品DNA与DNA芯片杂交，洗去未杂交样品DNA后，DNA芯片再分别与活化的羧基标记或醛基硫酸酯化标记的荧光微球反应，或与N-羟基丁二酰胺-长链生物素反应接上生物素后，与亲和素标记的荧光小球连接，冲洗液冲洗，吹干后检测。实施例3——杂交前方法之三(样品单链地高辛化)的实验步骤(1)经反应将地高辛连接到DNA样品单链上；(2)样品与DNA芯片杂交；(3)清洗未杂交DNA样品单链；(4)将带有地高辛抗体的荧光微球与DNA芯片反应；(5)洗去未反应的荧光微球；(6)检测DNA芯片。实施例4——杂交后方法之一的实验步骤(1)样品单链DNA与DNA芯片杂交；(2)洗去本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生物芯片检测的生物芯片杂交信号分子放大，包括：将样品单链ＤＮＡ加入到ＤＮＡ芯片中进行杂交反应，清洗和检测，其特征在于所说的样品单链ＤＮＡ加入到ＤＮＡ芯片中要通过杂交前方法或杂交后方法，将荧光微球特异地连接到ＤＮＡ芯片上杂交的双链ＤＮＮ上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李民乾，李宾，周志东，
申请(专利权)人：中国科学院上海原子核研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]