可通过从衍生于人大脑皮层的ｃＤＮＡ库中克隆得到编码具有糖转运活性之新的蛋白质ＨＵＣＥＰ－８的基因ｈｕｃｅｐ－８。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有糖转运活性的蛋白质及编码所说的蛋白质的DNA。
技术介绍
葡萄糖作为颅神经组织中的主要能源，虽具有低达180的分子量，但因其为极性分子而不能迅速通过细胞膜。因此，葡萄糖要通过葡萄糖转运蛋白，即以细胞膜的形式特异性存在的转运糖的蛋白质才能掺入细胞中。目前，已知有两种类型的葡萄糖转运蛋白，即针对葡萄糖浓度梯度主动转运葡萄糖的能量依赖性Na+/葡萄糖同向转运型，和以只依赖于细胞内和细胞外葡萄糖浓度差异进行转运的易化扩散转运型。一般认为易化扩散转运型在颅神经组织中执行主要作用，已报导了存在于血内皮细胞中并参予血脑屏障中糖转运的GLUT1(生物化学杂志，263,15245(1998))，和被认为通过血脑屏障向神经细胞内转运葡萄糖的GLUT3(生物化学杂志，265,18035(1990))。例如，有下列一些表明神经病变与葡萄糖转运蛋白的功能和表达异常之间关系的报导GLUT1部分缺乏引起惊厥和心理发生迟滞(N.Engl.J.Med.,325,703(1991))；帕金森氏病病例提示有GLUT3功能异常的可能性(Ann.Neurol.,32,S88(1992))；和肿瘤组织的血管内GLUT3的表达显著加速(癌症研究,52,3972(1992))。专利技术的公开本专利技术人认真地研究了由已经在人脑组织中特异性表达的基因所编码的蛋白质，因而在分离新的蛋白质(以下称为HUCEP-8)和编码该蛋白质的基因(以下称为hucep-8)上获得了成功。本专利技术人发现，这种HUCEP-8可将单糖如葡萄糖转运到细胞中，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供了(1)(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的新的蛋白质HUCEP-8，或(b)在具有经在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖转运活性的蛋白质；(2)编码(1)中所述任一蛋白质的基因；(3)(c)具有如SEQ ID NO:2所示之碱基序列的DNA，或(d)在严格条件下与SEQ ID NO:2的DNA杂交，并编码具有糖转运活性之蛋白质的DNA；(4)其特征在于使用(1)中所述的蛋白质筛选能够增强或抑制糖转运活性之化合物的方法；(5)其特征在于使用(2)或(3)中所述的基因筛选能够增强或抑制糖转运活性之化合物的方法；(6)筛选能够加速或抑制(2)或(3)中所述基因的转录之化合物的方法；(7)筛选能够加速或抑制(1)中所述任一蛋白质的转运之化合物的方法；(8)通过实施(4)、(5)、(6)或(7)中所述的筛选方法得到的化合物或其盐；以及(9)抗(1)中所述之蛋白质的抗体。附图的简要说明附图说明图1中，序列-1代表从大脑皮层cDNA库得到的重组体中有高出现率的DNA片段，并且序列-2至5各代表用于克隆涉及序列-1之DNA片段的寡核苷酸。图2显示涉及序列-1的DNA片段。图3和4显示含有基因hucep-8之DNA片段的碱基序列。图5显示重组载体pCRhucep-8的构建。图6显示重组载体pREhucep-8的构建。图7显示免疫印迹分析的结果。图8显示葡萄糖摄入试验的结果。实施本专利技术的最佳方式可作为含有hucep-8基因的cDNA片段，从衍生于人大脑皮层的cDNA库中分离所说的基因。本专利技术人使用的cDNA库是使用购自Clontech公司的人大脑皮层mRNA制备的，但同样也可以使用购自Stratagene公司的人大层皮层mRNA制备cDNA。可按照Okubo等人(Okubo等人，Nature Genet.,2,173(1992))所述的分析基因表达频率的方法，区分上述cDNA库中被认为在人脑组织内有可特异表达之基因的cDNA。具体地说，使用人大脑皮层mRNA作为模板，并使用将oligo(dT)结合到用适当的限制性酶开环的载体质粒的一端，然后再用限制性酶MboⅠ和Bam HⅠ切割而得到的引物，以合成cDNA。因为所说的载体是使用dam甲基化酶阳性大肠杆菌作为宿主制备的，所以载体的MboⅠ识别序列，即“GATC”的A残基已受到甲基化处理。因此，MboⅠ只切割新合成的cDNA部分。因为所说的载体只在已结合oligo(dT)之末端以外的末端附近有一个Bam HⅠ切割位点，所以该酶在这一个位点上切割所说的载体。如果新合成的cDNA部分中存在有Bam HⅠ识别序列，该位点上也将发生酶切割。因为Bam HⅠ和MboⅠ产生同样具有碱基序列“GATC”的粘性末端，所以可在用两种酶切割后，用DNA连接酶处理以使质粒闭环。在本专利技术所采用的方法中，使用如此制备的质粒转化大肠杆菌以构建cDNA库。因此，该文库含有各mRNA均从3’末端的poly(A)位点延伸到5’末端上第一次出现碱基序列GATC之位点的区域。从所说的cDNA库中随机选择适当数目的重组体，从各重组体中提取cDNA并测定其完整碱基序列。所说的方法使之有可能通过计数具有按上述方法确定的特异性碱基序列的cDNA片段，将在随机选择的重组体中证实的器官特异性基因和高表达频率基因与其它基因区分开。在所说的方法中，可按照本领域技术人员已知的任何方法(例如MolecularCloning,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lb.Press,1989和为本领域技术人员介绍标准方法的其它手册中所述的方法，以下称为常规方法)，从重组体中提取cDNA并测定cDNA碱基序列。在区分高表达频率基因的方法中，随机选择的重组体总数一般为数十个至数千个，但必要时也可处理更大数目的重组体。本专利技术人通过实施上述方法确定了770个重组体中所有cDNA片段的序列，并从这些cDNA片段中选择出具有出现频率如具有2/770或更多同样碱基序列之cDNA的cDNA片段，以作为具有在人脑中特异性表达之基因的DNA片段的侯选片段。如前所述，上述各个cDNA片段只含有mRNA之3’末端区域的一部分。因此，本专利技术人基于有关所说区域(下称3’片段)的碱基序列的信息得到了全长度cDNA。使用购自Clontech公司的人大脑皮层cDNA库作为模板，并使用具有上述3’片段中之碱基序列的适当长度的合成寡核苷酸，和具有载体中的序列的实质上同样长度的合成寡核苷酸作为引物，采用PCR方法得到了全长度cDNA。结果，能扩增约1.9kb的DNA片段。在这种情况下，也可使用购自Stratagene公司的人大脑皮层cDNA库作为模板。也可使用购自Clontech或Stratagene公司的人大脑皮层mRNA作为模板，借助Clontech或Gibco公司的5’RACE试剂盒进行扩增。此外，也可使用上述3’片段，按照常规方法经集落杂交或噬斑杂交筛选上述人大脑皮层cDNA库，以进行扩增。将按照上述方法扩增的各cDNA片段插入到得自Novagen的pT7Blue T-载体中，并用常规方法测定cDNA片段的整个碱基序列。在这种情况下，各cDNA片段独自得到了两个重组体DNA克隆，并测定了cDNA片段的碱基序列，从而进一步证实了碱基序列。可用Northern杂交技术证实所说的cDNA序列的器官特异性出现的频率，从而证实被认为存在于按上述方法选择之任何cDNA片段中的基因在脑组织中的特异性表达。具体地说，用琼脂糖凝胶电泳法分级分离从各种人体本文档来自技高网...
【技术保护点】
下列（ａ）或（ｂ）项的蛋白质：（ａ）具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示氨基酸序列的蛋白质；（ｂ）具有在如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一个或多个氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖转运活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉本真，矢崎圆，松本佳代，高山喜好，钓谷克树，
申请(专利权)人：大正制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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