鉴定调节钠/钙交换转运蛋白活性的化合物的方法技术

本发明专利技术涉及通过无细胞电生理传感器芯片测定Ｎａ↑［＋］／Ｃａ↑［２＋］交换（ＮＣＸ）蛋白活性的无细胞测定法、包含传感器芯片与ＮＣＸ蛋白质的试剂盒以及试剂盒的生产方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过无细胞电生理传感器芯片测定Na+/Ca2+交换(NCX)蛋白活性或活性的调节的无细胞测定法、包含传感器芯片与NCX蛋白质的试剂盒以及试剂盒的生产方法和用途。专利技术概述生命的一种基本要求是区室化——生物膜是实现该原则的天然工具。然而，细胞膜下的结构——脂双层对大部分离子和化合物都是不可通透的，所述离子和化合物的转运对于维持细胞和生物的重要功能是必要的。该矛盾的答案在于细胞膜的半透特性——必须穿过膜的溶质由特定膜蛋白转运。这些转运蛋白负责建立并维持离子梯度、吸收营养、转运代谢物、重吸收信号分子和处理有毒和废弃的化合物。因此，转运蛋白是潜在的药物靶标，其允许直接影响本文中的疾病相关的异常。大部分膜转运蛋白在进行其转运循环时改变电荷。该改变可始于带电底物的移动或始于带(部分)电荷的蛋白质部分的移动。监测转运蛋白相关电流在一些情况下，转运蛋白相关电流可在生理环境中通过膜片钳实验或在人造“黑质膜”中直接监测。在后一种情况下，在两种缓冲液储存器(各含有Ag/AgCl电极)间的小孔中产生脂双层。将蛋白质参入双层后，生物活性(例如酶活性)可通过例如光活化ATP衍生物触发。然而，由于其缺乏稳定性，用该系统不能进行快速缓冲液交换实验，将该体系限制于可光活化的底物。稳定性的缺乏可通过在传感器表面固定含蛋白质颗粒来克服。该事实为IonGate Biosciences GmbH，Frankfurt/Main的称为SurfE2R(表面生电事件读数器)的无细胞电生理学技术的原理，该技术检测产生的转运蛋白相关电流。类似的，还根据本专利技术，由带有转换器的基质和有孔盖板组成传感器芯片，形成类似滴定板孔的孔。玻璃或聚合物板作为合适的基质。就玻璃平板而言，转换器由薄的石印结构的表面被化学修饰的(例如通过硫醇)金膜组成，然而对于修饰的聚合物基质，也可使用厚膜金电极。由于合适基质的范围，可生产单传感器芯片以及传感器条或甚至具有96或384个传感器的传感器阵列板。特别是基于聚合物的传感器具有低成本大规模生产的潜力。具体的实例公开于WO02/074983和DE10244129。对所有传感器类型适用的是进行表面修饰后将金表面转化为电容器并用水溶液充满孔。该电容器的性质可借助于载流的参考电极如Pt/Pt或Ag/AgCl或氧化铟锡(ITO)或引入与溶液接触的其他电极确定。另外，传感器表面非常亲水，即对膜碎片和囊泡是粘性的。生电蛋白质保持在它们的天然或天然样环境，即容易吸附在亲水传感器表面的生物膜片、囊泡或脂蛋白体中，形成区室，其带有溶液的内部空间与金表面以及孔中周围溶液电隔离。如果插入小池，芯片的孔(图2A)限定了流动小室的内部体积，使得传感器表面上的快速溶液交换成为可能。从不含研究的蛋白质底物的溶液转换到含有的研究蛋白质的底物导致上述电容器的可测量的、瞬时充电电流，其通常在100pA到4nA范围内。在使用的工作站中，所有进行溶液交换实验必需的部件适应以PC或以其他方式控制的工作站。在常规系统中，非激活(即不含底物的)的溶液以及激活的溶液储藏在玻璃瓶中。应用于瓶上的气压驱动溶液穿过电机控制的阀门系统并穿过流动小室。另外，可使用自动采样器以自动化方式处理若干溶液。Na+/Ca2+交换蛋白(NCX)术语“NCX蛋白质”或“NCX”在本专利技术上下文中应指下列Na+/Ca2+交换蛋白质列表中任一种单独或彼此组合NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。特别优选的是NCX1、NCX2和/或NCX3。这类NCX蛋白质可来自任何脊椎动物，特别是哺乳动物物种(例如狗、马、牛、小鼠、大鼠、犬、兔、鸡、类人猿、人或其他动物)。NCX可分离自这类脊椎动物生物的组织探针或可通过能够表达NCX蛋白质的重组生物材料生产。术语“生物材料”是指含有遗传信息并能够自我复制或在生物系统中复制的任何材料。重组生物材料是通过本领域技术人员公知的重组技术产生、改变或修饰的任何生物材料。下列参考文献为克隆具体NCX蛋白质的实例犬Na+/Ca2+交换蛋白NCX1由Nicoll，DA.等克隆(Science.250(4980)562-5，1990；标题Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmalNa(+)-Ca2+exchanger.)。人Na+/Ca2+交换蛋白NCX1由Komuro，I.等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(10)，4769-4773，1992；标题Molecular cloningand characterization of the human cardiac Na+/Ca2+exchanger cDNA)和Kofuji，P.等(Am.J.Physiol.263(Cell Physiol.32)C1241-C1249，1992；标题Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissuesa study using thecloned human cardiac Na-Ca exchanger)克隆。人Na+/Ca2+交换蛋白NCX2由Li，Z.等克隆(J.Biol.Chem.269(26)17434-9，1994；标题Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+exchanger)。大鼠Na+/Ca2+交换蛋白NCX3由Nicoll，DA.等克隆(J.Biol.Chem.271(40)24914-21.1996；标题Cloning of a third mammalianNa+-Ca2+exchanger，NCX3)。人Na+/Ca2+交换蛋白NCX3由Gabellini，N.等克隆(Gene.2981-7，2002；标题The human SLC8A3 gene and thetissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3 isoforms)。钠/钙交换蛋白为从不同细胞去除Ca2+的重要机制。在心脏中，它排出通过Ca2+通道进入的Ca2+以起始收缩。其与心血管疾病的关联在例如Hobai，JA & O’Rourke，B(2004)Expert Opin.Investig.Drugs，13，653-664中说明。因此，制药工业已发展了抑制NCX的化合物，如Iwamoto，T.等(2004)J.Biol.Chem.，279，7544-7553中所述。如Hinata，M.等(2002)J.Physiol.545，453-461中通过电生理学方法所示，Na+/Ca2+交换蛋白对每个反方向移动的Ca2+生电转运三到四个Na+。NCX能够将细胞质Ca2+浓度(内)维持在比细胞外Ca2+浓度(外)低三到四个数量级。然而，净Ca2+转运的方向依赖于Na+的电化学梯度。对Na+和Ca2+转运已提出了同时和连续转运模型，大量证据倾向于后者。本领域技术水平公知NCX蛋白质的活性可通过活细胞测定。对该目的而言，蛋白质必须在细胞中表达且细胞必须增殖。这类系统已由Ax本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定ＮＣＸ蛋白质活性的体外测定法，其中包含ＮＣＸ蛋白质的传感器芯片通过洗涤、非激活和激活连续地逐步处理，然后当从非激活改变为激活处理时测量电流。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H福勒特，S盖伯尔，B凯莱蒂，W德尔纳，
申请(专利权)人：塞诺菲安万特德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]