以线粒体DNA损伤作为冠状动脉粥样硬化性心脏病的预报制造技术

本发明专利技术证明，线粒体ＤＮＡ损伤的发生先于动脉粥样硬化损伤的发展，或与之同步；主动脉线粒体ＤＮＡ损伤随年龄增加；而且，基因型和饮食都会影响线粒体ＤＮＡ损伤程度。因此，本发明专利技术证明，线粒体ＤＮＡ损伤发生于动脉粥样硬化的早期，可能是动脉粥样硬化形成的引发因素，并基于此提供了一种根据线粒体ＤＮＡ损伤量来预报冠状动脉粥样硬化性心脏病的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及生理学和分子生物学。更具体地说，本专利技术涉及DNA损伤及其对于动脉粥样硬化的影响。相关技术据信，反应性氧物质在动脉粥样硬化损伤的发病机理中起着重要作用(1-6)，但对于其内在机制尚不清楚。例如，反应性氧物质介导的机制可能是LDL氧化(ox-LDL)的一个重要因素，是动脉粥样硬化形成的一个关键情节(3，7，8)。研究表明，超氧化物(O2-)和过氧亚硝酸盐(由O2-与一氧化氮形成)能够氧化LDL(9-11)。因此，据信，与一氧化氮和/或O2-相关的反应在动脉粥样硬化损伤和血管功能损伤(即内皮细胞机能失调)的发病机理中起着重要作用，但对它们的氧化产物(H2O2，过氧亚硝酸盐)的作用尚不完全清楚。线粒体是细胞内反应性氧物质(O2-)的主要来源之一，这些反应性氧物质形成于电子转运过程中(12-16)。这些反应性氧物质会优先损伤线粒体膜和蛋白质(17-19)，影响重要的细胞功能，包括线粒体的呼吸，这一功能的改变会导致反应性氧物质产生增加(20-22)，引起脂类过氧化(23，24)和DNA损伤(25，26)。由于线粒体的氧化磷酸化能力因线粒体DNA(mtDNA)损伤而降低，突变随年龄累积(6，27-29)，所以，线粒体损伤和反应性氧物质的产生可能成为衰老相关性退行性疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)的催化剂。据假设，内皮细胞和平滑肌细胞内产生的自由基引起这些细胞内的线粒体损伤，形成一个反应性氧物质进一步产生和线粒体损伤的恶性循环，导致血管细胞机能失调。在西方，冠状动脉粥样硬化心脏病是导致死亡的主要原因。虽然对于导致冠状动脉粥样硬化心脏病原因的确切顺序存在着相当的争论，但越来越多的证据表明，动脉粥样硬化损伤是由反应性氧物质介导的因素引起的。巨噬细胞通过“清除者”受体识别并内化ox-LDL形成泡沫细胞。这些泡沫细胞的积累关系到血管生理的长期变化，包括平滑肌细胞迁移和增殖，细胞外基质蛋白的合成和进一步的内皮细胞机能失调，这些都是动脉粥样硬化损伤的主要构成因素。同样，冠状动脉粥样硬化心脏病的许多危发因素都与反应性氧物质产生的增加相关(即，吸烟和高血胆固醇)。在动脉内，反应性氧物质可由代谢过程(线粒体的氧化磷酸化)产生，细胞因子或生长因子活化，巨噬细胞或嗜中性白细胞刺激(炎性反应)，和一氧化氮与超氧化物产生过氧亚硝酸盐的反应，这些都继而产生单态氧和羟基自由基。因此，虽然有许多过程对于动脉粥样硬化很重要，但反应性氧物质介导的机制及其作用属于最重要的。大量研究显示，线粒体很容易受反应性氧物质的作用。线粒体DNA与内膜基质侧的结合使得它易受膜干扰的影响，并使它成为膜内产生的亲电体的潜在目标。除了它与内膜和OXPHOS的密切结合之外，造成线粒体DNA易于损伤的其他因素是缺乏保护性组蛋白和非组蛋白，及其有限的DNA修复能力。此前的研究表明，线粒体易受反应性氧物质介导的损伤，表现为广泛的脂类过氧化和线粒体DNA损伤。具体地说，已有报道，以反应性氧物质处理内皮细胞优先造成线粒体DNA损伤，降低线粒体DNA转录，以及线粒体XOPHOS机能失调。现有技术缺乏测定造成动脉粥样硬化的氧化应力的方法。本专利技术满足了本领域内长期以来的这一需求。专利技术概述本专利技术证明，在体外，反应性氧物质介导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)内的线粒体损伤和机能失调。本专利技术测定了以H2O2、过氧亚硝酸盐和O2-处理的细胞内的DNA损伤，基因表达和线粒体蛋白质合成。两种细胞内的线粒体DNA都比核DNA更容易受微量反应性氧物质的影响，并与线粒体所编码多肽的OXPHOS转录(ND2和细胞色素b)减少(40-60％)相关。氧化亚硝酸盐处理抑制线粒体蛋白质的合成，反应性氧物质处理的细胞其ATP水平和线粒体呼吸(复合物II)也显著降低，这与反应性氧物质损害线粒体功能的观点一致。本专利技术揭示了，在体外，氧化性线粒体DNA损伤，基因表达改变和线粒体机能失调之间的关联，由此证明，氧化性细胞损伤和线粒体损伤在血管机能失调和动脉粥样硬化中起着重要作用。因为线粒体更容易发生反应性氧物质介导的损伤，而且，氧化应力的升高被认为在动脉粥样硬化的早期起着重要作用，本专利技术证明，在最终发生动脉粥样硬化的主动脉组织内的线粒体DNA损伤增加。为此，将动脉粥样硬化研究用的高血胆固醇小鼠模型(无载脂蛋白E的小鼠)主动脉组织内恒定的线粒体DNA损伤水平与健康的同龄对照小鼠相比较。DNA损伤评估发现，apoE小鼠主动脉组织的线粒体DNA损伤在形成病理学上可测的损伤之前和之后都显著增加(与健康对照相比)。此外，所有小鼠的线粒体DNA损伤都随年龄增加，但只有apoE小鼠具有与年龄相关的损伤水平的显著增加(p＜0.05)。相反，只在10周龄的c57B1小鼠内，饮食才与线粒体DNA损伤相关，表现为西式饮食与损伤增加相关。最后还发现，食物蛋白质的减少与apoE和对照小鼠主动脉内线粒体DNA损伤减少都显著相关(p＜0.05)。没有发现明显的与β球蛋白基因座(核DNA损伤的标记)相关的损伤模式。对各动物组的组织化学分析显示，只在饲以中式饮食(4％脂肪)和西式饮食(21％脂肪)的衰老apoE小鼠中存在动脉粥样硬化损伤。如同预计的，与同龄c56B1对照相比，apoE小鼠的脂类过氧化物和胆固醇水平显著升高(＜0.05)。然而，与饲以中式饮食的相比，饲以脂肪含量更高的西式饮食的apoE小鼠的脂类过氧化物水平并没有显著升高。所以，以上信息提示1)在动脉粥样硬化小鼠活体模型中，线粒体DNA损伤先于或与动脉粥样硬化损伤形成同时发生；2)在体内，主动脉线粒体DNA损伤随年龄增加；3)与饮食相比，apoE基因型对于线粒体DNA损伤水平影响更大；以及4)饮食对于线粒体DNA损伤的影响在年幼的c57B1小鼠中似乎最显著。因此，线粒体发生于动脉粥样硬化的早期，可能是动脉粥样硬化形成的引发事件。本专利技术目的之一是提供预报冠状动脉粥样硬化性心脏病以及其他氧化应力所致疾病的方法，该方法以线粒体DNA损伤程度为基础，或以相关的线粒体DNA损伤引起的线粒体机能失调有关测定(线粒体蛋白质合成改变，线粒体氧化磷酸化改变或线粒体ATP产生改变等)为基础。本专利技术实施例之一中，提供了预报危发个体动脉粥样硬化的方法，其步骤包括(a)采集个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织中的线粒体DNA损伤量(mtDNA)；和(c)将所述危发个体有意义组织内的线粒体DNA损伤量与无动脉粥样硬化对照个体的有意义组织内的线粒体DNA损伤量比较，危发个体线粒体DNA损伤量高于所述对照个体表明该个体患有动脉粥样硬化危发性。本专利技术另一实施例中，提供了一种测定个体内氧化应力的方法，包括(a)采集所述个体的有意义组织；(b)测定所述有意义组织内的线粒体DNA损伤(mtDNA)；(c)测定所述有意义组织内一核基因中的DNA损伤；和(d)比较线粒体DNA和核基因DNA之间单位长度上的DNA损伤量，线粒体DNA单位长度上的DNA损伤量高于核DNA表明所述个体内氧化应力升高。本专利技术的再一实施例中，提供的方法测定降低个体发生冠状动脉疾病危险性的处理方法的效果，其步骤包括(a)采集处理前所述个体的外周血白细胞；(b)采集个体经处理后的有意义组织；和(c)测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估个体动脉粥样硬化状态的方法，包括： （ａ）采集所述个体的有意义组织； （ｂ）测定所述有意义组织中的线粒体ＤＮＡ损伤量； （ｃ）将所述个体有意义组织内的线粒体ＤＮＡ损伤量与无动脉粥样硬化对照个体的有意义组织内的线粒体ＤＮＡ损伤量比较，危发个体线粒体ＤＮＡ损伤量高于所述对照个体表明该个体患有动脉粥样硬化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MS朗格，SW巴林杰，B范豪藤，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]