一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用。所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白LvFREP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术首次从凡纳滨对虾中克隆出纤维蛋白原基因LvfreP，通过实验证明该基因表达产物LvFREP在体外对多种细菌具有强烈凝集作用，在虾体内可快速帮助虾体清除细菌。因此，本发明专利技术所提供的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP和纤维蛋白原LvFREP为筛选具有优良性状的凡纳滨对虾家系提供了遗传标记，也为凡纳滨对虾遗传改良提供了新的靶位点。

A fibrinogen LvFREP and its encoding gene and its application in Penaeus vannamei

The invention discloses a fibrinogen LvFREP of Penaeus vannamei and its encoding gene and its application. The Litopenaeus vannamei fibrinogen gene LvfreP nucleotide sequence of SEQ ID NO.2 shows, its amino acid sequence encoding LvFREP protein is shown as SEQ ID NO.3. The invention first cloned the fibrinogen gene LvfreP from Litopenaeus vannamei, and proved by experiment that the LvFREP of the gene expression has strong agglutination effect on many kinds of bacteria in vitro, and it can quickly help shrimp body to eliminate bacteria in shrimp. Therefore, the fibrinogen gene LvfreP and fibrinogen LvFREP of Litopenaeus vannamei provide genetic markers for screening families with good traits and provide new target sites for genetic improvement of Litopenaeus vannamei.

【技术实现步骤摘要】
一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用
：本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用。
技术介绍
：纤维蛋白原(Fibrinogen)在人体中是一种具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体。除了参与凝血、止血外，还发挥多种功能，它可与多种细胞结合、参与人类癌症反应，并在细胞粘附以及炎症反应中起重要作用。目前，纤维蛋白原被报道广泛存在于脊椎和无脊椎动物的组织中。在无脊椎动物中，由于缺乏获得性免疫，其主要依赖体液中各免疫因子的共同作用抵御外来病原菌侵染。模式识别受体(Patternrecognitionreceptors，PRRs)是激活非特异性免疫的重要免疫因子。目前在无脊椎动物中已发现多种PRRs，其中最主要的PRRs是可识别微生物表面的凝集素；这些凝集素参与起始免疫反应。据报道，纤维蛋白原作为凝集素在多种无脊椎动物的免疫反应过程中发挥重要作用。纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-relatedproteins，FREPs)是具有保守纤维蛋白原结构域(Fibrinogen-likedomain,FReD)的一类蛋白。FReD主要由大约200个氨基酸残基组成，并含有24个保守氨基酸残基。FREPs作为PRRs参与无脊椎动物的免疫反应已在多种无脊椎动物中得到报道，包括紫怡贝(Mytilusgalloprovincialis)、海兔(Aplysiacalifornica)、长牡蛎(Crassotreagigas)、热带按蚊(Neotropicalanopheline)等，但在虾类中报道极少。目前我们已经在凡纳滨对虾中发现10个FREPs转录本，但其功能有待进一步验证。凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾，属暖水性经济虾类。由于其具有盐度温度适应范围广、耐干性强、肉质鲜美、个体较大等优点，在世界各地被广泛养殖，凡纳滨对虾养殖产业已成为我国水产养殖的支柱性产业。然而，近年来由于对虾传染病频繁大规模爆发，给对虾养殖产业造成巨大损失的同时，也威胁着产业的健康和可持续发展；且抗生素等药物的广泛使用造成药物残留，环境污染，并产生抗药性菌株等负面影响。因此提高对虾机体的抗病力、选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种，一直是对虾种业和养殖业发展的追求目标，已成为近十年来对虾种业发展的关键。其中，探索阐述虾类免疫防御机制是非常重要的基础工作，探查免疫功能基因及其功能也可以加快从遗传工程或遗传选育途径进行的育种工作。纤维蛋白原相关蛋白作为模式识别受体，可能在对虾非特异免疫反应中发挥重要作用。研究凝血纤维相关蛋白在凡纳滨对虾中的免疫调控机制，可为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供遗传标记，同时也可为对虾遗传改良提供新的靶位点。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用。本专利技术的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP的核苷酸序列进行修改，也属于本专利技术的保护范围内。优选，所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术根据凡纳滨对虾转录组数据中的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP部分基因序列，设计了特异性引物。提取凡纳滨对虾鳃组织的RNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，采用上述特异引物进行3’RACE和5’RACE扩增出LvfreP基因的3’端片段和5’端片段，分别连接到pMD19-T载体上，获得重组载体pMD19-LvfreP1和pMD19-LvfreP2，获得的序列与原有转录组基因中间序列进行拼接，获得了LvfreP基因的全长序列。LvfreP基因包含一个开放阅读框，为1479个碱基，其序列如SEQIDNO.2所示，将此基因命名为LvfreP，其编码蛋白具有492个氨基酸残基(其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示)，将该蛋白命名为LvFREP。将LvFREP氨基酸序列进行Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，发现LvFREP最相似的序列来源于文昌鱼(Branchiostomabelcheri)的Ficolin-2-like蛋白，但二者仅存在43％的一致值(如图2所示)，数据库中不存在完全一致的蛋白序列，说明LvFREP是一个新发现的蛋白。同时，采用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)将LvfreP基因与NCBI数据库进行比对，结果为没有发现明显的相似性，因此LvFREP的编码基因LvfreP也是一个新的基因。本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP的重组表达载体。所述的重组表达载体中的表达载体优选为原核表达载体pET28b。考虑到表达载体的多样性，对表达载体更换，但表达基因的核心为LvfreP基因，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述的重组表达载体的细菌。所述的细菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术发现纯化后的LvPREP可导致多种不同来源的细菌发生明显凝集，包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)。将纯化的LvFREP蛋白与哈氏弧菌共同孵育后，注射到凡纳滨对虾体内，分别在不同时间点抽取对虾血淋巴，LB琼脂平板计数血淋巴细菌数量，发现LvFREP蛋白具有明显且快速的清除对虾体内细菌的作用。因此，本专利技术的第五个目的是提供上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP在制备细菌凝集制剂中的应用。所述的细菌优选为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、创伤弧菌(Vibriovμlnificus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)或哈氏弧菌(Vibrioharveyi)。本专利技术的第六个目的是提供上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP在制备清除动物体内细菌药物中的应用。所述的动物优选为凡纳滨对虾(Litopenaeusvanna本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.一种编码权利要求1所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP。3.根据权利要求2所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种含有权利要求2所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因LvfreP的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中的表达载体为原核表达载体pET28b。6.一种含有权利要求4所述的重组表达载体的细菌。7.根据权利要求6所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21(DE3)。8.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗鹏，田雨顺，陈廷，黄文，胡超群，霍达，云龙，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44