用于检测铜绿假单胞菌的新的酶底物,含有它们的组合物,以及检测此菌种的方法技术

本发明专利技术涉及由一个靶部分和一个标记部分组成的酶底物，底物的水解导致靶部分从标记部分分离，所述靶部分对于所测定的酶活性是特异性的。本发明专利技术还涉及含有至少一种该底物的组合物，以及检测菌种铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）的方法。该底物的标记部分能显示β－丙氨酸氨肽酶活性，而标记部分是显示水解反应是否发生的化合物。本发明专利技术特别适用于诊断领域。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,含有它们的组合物,以及检测此菌种的方法
本专利技术涉及一种可用于检测β-丙氨酸氨肽酶活性的试验的底物，本专利技术还涉及含有至少一种该底物的制剂，以及检测菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的方法。多年以来，人们使用特异性的底物以确定微生物特征性的酶活性的存在与否。通过选择特异性的底物，在反应是否发生的基础之上，有可能明确微生物属的特性，或区分某一属中的不同菌株和/或菌种。合成的酶底物由两个不同部分组成第一部分是对所测试的酶活性特异性的，下文中称之为靶部分；第二部分作为一个标记，下文中称之为标记部分。这些特异性的底物可以是荧光的或产色的。实际上，当第二部分即标记部分不再与第一部分即靶部分相联时，它或它与一或多种其他化合物反应的产物会产生荧光或显色(参见以申请人名义提出的专利申请PCT/FR99/00781)。现有技术未提供任何简单试验来表征菌种铜绿假单胞菌，尽管由于其致病性强，频繁发生广泛扩散及其在许多医院感染中的作用，此菌种仍是最常研究的菌种之一。根据本专利技术，提供了一系列基于β-丙氨酸的底物，它们均有助于可靠地检测铜绿假单胞菌。本专利技术还涉及含有至少一种该底物的制剂，以及检测铜绿假单胞菌的方法。当然，β-丙氨酸是一种特征已经非常明确的底物。因此，在Kasafirek，Evzen等标题为“由胰弹性蛋白酶裂解的氨基酸残基在产色底物中的作用”(Role of amino acid residues in chromogenic substratescleaved by pancreatic elastase)，发表在捷克化学通讯集(Collect.Czech.Chem.Commun.)(1987)，52(6)，1625-33的一篇论文中提及了产色底物，如β-丙氨酰对硝基苯胺(合成途径参见1631页)。上述文献与本专利技术的区别，对我们而言是基本的区别，在于靶物本身，即我们感兴趣的是铜绿假单胞菌，而不是胰弹性蛋白酶。在由J.B.Suszkiw，A.S.Brecher发表的一篇论文中，关于“脑氨酰基芳基酰胺酶。可溶性牛酶的进一步纯化以及关于底物特异性和可能的活性位点残基的研究”(Brain Aminoacyl Arylamidase.FurtherPurification of the Soluble Bovine Enzyme and Studies on SubstrateSpecificity and Possible Active-Site Residues)，发表在生物化学(Biochemistry)，vol.9，no.20(1970)，4008-4017页，提出了一种从牛脑组织中纯化可溶性芳基酰胺酶，β-丙氨酸β-萘胺的方法(合成途径参见4010页，第二段)。在这篇文献中，其靶物也与我们现在提出的完全不同。为达到此效应，本专利技术涉及一种由靶部分和标记部分组成的酶底物，水解该底物使标记部分和靶部分分开，所述靶部分对所测定的酶活性是特异性的，其特征在于该靶部分能受来源于至少一个铜绿假单胞菌的β-丙氨酸氨肽酶的作用起反应；而标记部分是显示水解反应是否发生的分子。根据优选实施方案，靶部分由β-丙氨酸或其衍生物构成，而标记部分是荧光分子或产色分子。再根据优选实施方案，底物具有下列结构式H2N-CH2-CH2-CO-NH-R，其中，H2N-CH2-CH2-CO-是靶部分，而-NH-R是底物的产色或荧光标记部分。再根据优选实施方案，标记部分包括下列化合物-β-萘胺，-氨基甲基香豆素，如7-氨基-4-甲基-香豆素，-氨基苯衍生物，如4-氨基-2，6-二氯苯酚，-对硝基苯胺，或-2-氨基-吲哚酚或3-氨基-吲哚酚。本专利技术还涉及用于检测至少一个微生物菌株和/或菌种的制剂，其包括至少一种如上所述的底物，加上培养基。根据修改，用于检测至少一个微生物菌株和/或菌种，或至少两个微生物菌株和/或菌种的制剂，其包含至少一种如上所述的底物，加上至少一种其他底物和培养基。根据修改，所述培养基包含显色剂。在这种情况下，培养基中的显色剂是-重氮盐，当释放的标记是β-萘胺，或-3，5-二羟基-2-萘甲酸，当释放的标记部分是氨基苯衍生物。优选该制剂为液体肉汤或半固体琼脂培养基的形式。最后，本专利技术涉及检测菌种铜绿假单胞菌的方法，该方法包括-将至少一种能检测β-丙氨酸氨肽酶活性的底物与怀疑含有至少一个铜绿假单胞菌的样本接触，并-观察颜色反应和/或荧光反应的出现。根据修改，检测菌种铜绿假单胞菌的方法包括-将至少一种能检测β-丙氨酸氨肽酶活性的底物与怀疑含有至少一个铜绿假单胞菌的样本接触，-将至少一种能检测除β-丙氨酸氨肽酶外某种酶活性的底物与怀疑含有至少一个除铜绿假单胞菌外的微生物的样本接触，这另外的酶活性可区分铜绿假单胞菌和这另外的微生物，并-观察颜色反应和/或荧光反应的出现。在上述两个实施例中，培养基均是半固体。在这种情况下，将某些产物加入培养基，以抑制产生的颜色的扩散。本专利技术涉及一个生物学参数的开发利用，其对菌种铜绿假单胞菌的大多数菌株是特异性的，称为β-丙氨酸氨肽酶活性。该活性仅在极少数量的其他菌种中发现。本专利技术在于将适合的标记部分与对此酶特异性的靶部分，即β-丙氨酸结合在一起。显示此活性的适合的标记部分已经存在，但迄今未被用于铜绿假单胞菌的检测，因为先前从未描述过此菌种和此酶活性之间的联系。因此，第一组底物由以萘胺为标记部分的分子组成。结构式之一——对应于底物β-丙氨酰-β-萘胺——是 其中R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。β-萘胺能用于检测β-丙氨酸氨肽酶活性，如由Mr.Daniel Monget于1978年7月4日在Universite Claude Bernard-Lyon I工程学博士论文答辩(序号n°297)中所描述的。由于这种类型的分子是无色的，这一组底物的成员必须与某种显色剂，如重氮盐一起使用。
技术介绍
的第二组底物由标记部分基于氨基甲基香豆素的化合物组成，该标记部分从靶部分释放后，会产生荧光。这一组底物的通式可由下列β-丙氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素的特定结构式推导出 其中R9、R12、R13、R14和R15在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。这一类型的底物不宜在半固体培养基中使用，而更常用于液体肉汤中。底物的第三组由β-丙氨酰-4-氨基-2，6-二氯苯酚组成，其中标记部分是2，6-二氯氨基苯酚，其具有下列结构式 其中R16和R17在各自位置代表原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH。这一类型的化合物已经在由本申请人提出的专利申请WO-A-99/51767中涵盖，并需要干显色剂如3，5-二羟基-2-萘甲酸的存在。同一专利申请(WO-A-99/51767)还显示了有可能使用其他化合物，其中两个氯原子以及羟基基团在各自位置被原子氢、溴、氯或碘，或基团如-OH、-CH3、-CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3或COOH取代。本文档来自技高网...

【技术保护点】
由一个靶部分和一个标记部分组成的酶底物，底物的水解导致靶部分和标记部分分离，所述靶部分对所测定的酶活性是特异性的，其特征在于靶部分能受来源于至少一个铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）的β－丙氨酸氨肽酶的作用起反应；而标记部分是显示水解反应是否发生的分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M戴斯芒思奥克斯，D蒙盖特，
申请(专利权)人：拜奥默里克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]