在三维生物反应器中生产来自体内的功能性白血病细胞制造技术

本发明专利技术提供了培养的白血病细胞。该方法包括分离包括白血病细胞在内的单核细胞在具有覆盖或包围了培养基的支架的室中培养这些白血病细胞，其中的支架使白血病细胞之间能够在三维方向上互相接触。受试者的白血病细胞可用于筛选抑制或刺激白血病细胞的功能或形成的化合物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养领域，而且尤其是有关培养白血病细胞的方法和组合物。
技术介绍
白血病是起始于骨髓—柔软的骨骼中心部分中造血细胞的一种癌症形式。白血病—按照字面是希腊语的“白色血液”的意思—当血液中有过量的异常白细胞时发生。在一些个体中这些被称作白细胞的细胞十分丰富，以至于血液的确有发白的色调。在通常情况下，骨髓中的造血细胞制造白细胞以保护身体使其抵抗象病毒和细菌一类的生物体的感染。但是如果一些白细胞被破坏并且仍然是未成熟的形式，这些白细胞抗感染能力会下降，它们过量繁殖并且不像它们本应当的那样死亡。白血病细胞积聚并且使携氧的红细胞(红血球)，凝血细胞(血小板)，以及正常的白细胞减少。如果不予以治疗，过剩的白血病细胞将充满骨髓，进入血流中，并最终入侵身体的其它部分，例如淋巴结，脾脏，肝脏，和中枢神经系统(即大脑，脊髓)。因此，白血病同通常起始于实体器官并可能扩散到骨髓的其它的癌症的情况不同。有超过12种类型的白血病，但是下面的四种类型是最常见的急性淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓细胞性白血病(AML)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，以及慢性髓细胞性白血病(CML)。急性白血病通常发病突然，而有一些慢性类型可能在被诊断前存在了多年。通常白血病被认为是一种儿童期疾病。事实上，成年人的白血病患者是儿童的十倍。美国癌症学会预测1999年在美国会诊断出有大约30,200个新的白血病病例-27,900个成人和2,300个儿童。报道的成人急性白血病中最多报道的类型是急性髓细胞性白血病(AML)，并且预测在1999年有大约10,100个新病例。30,200个最新的病例中大约有41％是慢性白血病—估计有7,800个慢性淋巴细胞性白血病(CLL)病例以及4,500个慢性髓细胞性白血病(CML)病例。另外，毛细胞性白血病(HCL)，一种缓慢发展的淋巴细胞癌，大约占到604个病例(所有白血病的2％)。悲观的估计，在1999年大约有22,100个美国成人和儿童会死于白血病。急性髓细胞性白血病(AML)是最常见的成人白血病，每年每100,000人中有近5人感染。慢性白血病，象许多其它癌症一样，是一种“老年疾病”。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的平均年龄约70岁，而慢性髓细胞性白血病(CML)患者的平均年龄为40到50岁。与之相反，急性淋巴细胞性白血病(ALL)绝大多数是儿童疾病，通常出现在10岁以下的儿童中。总之，在全世界男性中白血病患者比女性患者多，尽管西方国家CLL患者的男∶女比例是最高的。由于白血病是一种多发疾病，仍然需要新的治疗白血病的方法。因此，开发一种最接近于体内环境的体外白血病细胞培养系统变得很重要。白血病细胞在白血病患者体内比正常造血细胞具有选择性生长优势，但是体外的情况正好相反。鼠模型被用于研究白血病以及不同的治疗方法对疾病的效果。但是，鼠和人生理学上的不同反映出鼠模型是不够的。白血病细胞非常难于生长和维持以至于不能在体外形成集落，这一特点被用于一些髓细胞性白血病的分类；正常的细胞在体外有选择性生长优势。这种优势通过无法建立患有费城(Ph1)染色体阳性慢性髓细胞性白血病患者细胞的长期德克斯特型悬浮培养物所证明。经过几个周或几个月，具有Ph1核型的细胞数量减少直到无法测出，并且正常有丝分裂的数量增长到100％。现在利用这些情况下在体外相对没有存活能力的特点来清除人骨髓中的残留白血病细胞，从而在几天后以没有白血病细胞的自体骨髓移植形式回输到患者体内。被移植的细胞在源自骨髓环境的条件下培养，因为德克斯特培养仅仅在二维条件下支持细胞生长。虽然倾向于在体外使正常细胞比白血病细胞生长得快或者使白血病细胞死亡，但是已经开发了一些在短期培养物中生长白血病细胞的方法。最常用的方法包括在软琼脂或甲基纤维素中形成白血病细胞集落。生长白血病细胞集落的技术首先采取在半固体培养基中培养正常造血集落形成先祖细胞的系统，然后针对白血病细胞的特殊需要进行了改进。大多数白血病集落形成的研究是有关急性非成淋巴细胞性白血病(ANLL)细胞以及原型白血病集落的测定。白血病细胞可以从外周血液，骨髓抽取物或者活组织检查中获得或者罕见地由绿色肉瘤或脾脏中获得。制备用于培养的白血病细胞的步骤必需去除可能对细胞有害的酸性肝素，去除可能抑制细胞生长的患者的血清，去除使得白血病细胞不容易看清的红细胞，以及去除可能抑制白血病细胞生长的细胞例如粒细胞。有时候，也去除掉那些可能刺激生长的细胞(例如T—淋巴细胞和单核细胞)或者可能自身形成集落从而使其与白血病集落不容易区分的细胞。第二种方法是在悬浮培养物中培养白血病细胞。大多数白血病细胞在含胎牛血清的培养基中只能够存活几天。最后，第三种支持白血病细胞生长的方法是将人细胞异种移植到象裸鼠眼前房一类的位置中。现在很清楚造血细胞和白血病细胞在体内和体外的生长是集落刺激因子，生长因子，以及生长因子受体之间复杂的相互作用的结果。这些因子可以是体内血浆中存在的体液因子；它们可以是由白血病细胞自己生成的自分泌因子，也可以是依赖于造血微环境中细胞与细胞间相互作用的旁分泌因子。已经尝试用预先建立的基质细胞支持基质来建立长期骨髓细胞培养物，其中培养物中的基质提供维持细胞长期活性增殖所必需的支持，生长因子，以及调节因子。(Naughton)等，“在悬浮尼龙滤网—基质细胞微环境中血细胞的生成”英国生物化学杂志113171-177(1991))。它部分是基于以下发现，即基质细胞在尼龙滤网模板上生长时细胞活性增殖时间比在单层系统中保持得更长。该滤网模板是平面的，基本由具有最小深度的二维基质组成，深度取决于尼龙网眼线的厚度。一直缺少一种培养白血病细胞的一致的细胞培养系统。需要一种长期白血病细胞培养系统以鉴定白血病先祖细胞，确定调节白血病细胞增殖和分化的分子，并筛选潜在的化学治疗制剂。本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷。专利技术概述本专利技术提供一种培养白血病细胞的方法。本方法包括分离包括白血病细胞在内的单核细胞，并在具有覆盖或包围了培养基的支架的室中培养细胞。该支架使得细胞能够在三维方向上互相接触。非强制性地，可以用白血病细胞向培养基中再接种。这一步骤也可用于产生白血病细胞。本专利技术也提供了一种筛选在个体基础上筛选药物治疗白血病的效力的方法。该方法包括分离包括白血病细胞在内的单核细胞，在具有覆盖或包围了培养基的支架的容器中培养细胞，其中支架使得细胞在三维方向上能够互相接触，向容器中加入检测化合物，并鉴定这种检测化合物是否抑制白血病细胞的生长。该检测化合物可以是单一的化合物，一系列化合物或化合物的组合，具有不同的检测用量和/或持续时间。本专利技术也包括用在测定中已经确定能够抑制白血病细胞的化合物来治疗白血病患者。本专利技术进一步涉及一种鉴定与白血病细胞形成或功能相关的基因的方法。该方法包括分离包括白血病细胞在内的单核细胞，在具有覆盖或包围了培养基的支架的容器中培养细胞，其中所述的支架使细胞能够在三维方向上互相接触，在检测培养物中改变一个或多个培养条件，在检测样品中鉴定白血病细胞的数量和功能，并筛选出同检测样品中白血病细胞数量或功能的变化相关的一个或多个基因。可以用许多不同的已知方法来筛选基因，例如差别基因显示，RNA任意引物(RAP)-PCR，或者基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养白血病细胞的方法，包括：分离包括白血病细胞在内的单核细胞并在具有被培养基覆盖或包围的支架的室中培养，其中所述的支架使得白血病细胞之间能够在三维方向上相互接触。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JHD吴，A曼塔拉里斯，N帕诺斯卡尔蒂斯，
申请(专利权)人：罗切斯特大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]