一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法技术

本发明专利技术提供了一种基于UPLC‑QTof/MS的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法。包括：制备样品溶液及对照品溶液；采用UPLC‑QTof/MS进行检测，根据检测结果，确定巴戟天低聚糖成分。本发明专利技术优化了巴戟天药材低聚糖的色谱和质谱分离和检测条件，利用Acquity UPLC BEH Amide C18柱，通过UPLC‑QTof/MS检测系统，成功分离并鉴定了巴戟天药材中19个低聚糖成分，为巴戟天创新药物开发研究提供科学依据。

A method for the identification of Morinda officinalis oligosaccharides.

The present invention provides a method for the identification of UPLC QTof/MS of Morinda officinalis oligosaccharides based on. Including: preparation of sample solution and the reference solution; using UPLC QTof/MS were detected according to the detection results, determination of Morinda officinalis oligosaccharides. The invention optimizes the medicinal materials of Morinda officinalis oligosaccharides of chromatography and mass spectrometry separation and detection conditions, the use of Acquity UPLC BEH Amide C18 column by UPLC QTof/MS detection system, successfully isolated and 19 oligosaccharides of Morinda officinalis medicinal materials were identified, and provide scientific basis for research on innovative drugs of Morinda officinalis.

【技术实现步骤摘要】
一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法
本专利技术属于中药化学成分分析
，具体涉及一种基于UPLC-QTof/MS的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法。
技术介绍
中药巴戟天为茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow的干燥根，主产于广东、福建、广西、海南等地，是传统补肾阳的良药，为四大南药之一，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效。巴戟天主要含有糖类、脂类、蒽醌、有机酸等成分。目前，从巴戟天药材中分离鉴定的糖类成分有果糖、蔗糖、巴戟甲素、蔗果三糖、耐斯糖、IF-果呋喃糖基耐斯糖、菊粉二糖至七糖。低聚糖因其广泛的生物活性是目前研究热点之一，但是目前对巴戟天中药效显著的低聚糖糖产品的研发相对滞后，低聚糖的鉴定主要采取提取、分离和纯化或衍生化后，再利用核磁共振谱、质谱等方法鉴别，实验耗时长，费用大；并且未见有对巴戟天低聚糖成分进行全面表征的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于UPLC-QTof/MS的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法。本专利技术所提供的基于UPLC-QTof/MS的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法，包括下述步骤：1)制备样品溶液及对照品溶液：将巴戟天的根干燥、粉碎、过筛，用甲醇水溶液超声提取，离心，收集上清液，将上清液过滤，得到样品溶液，备用；用甲醇水溶液将对照品溶解，得到对照品溶液，备用；2)采用UPLC-QTof/MS进行检测，根据检测结果，确定巴戟天低聚糖成分。上述方法步骤1)中，所述过筛具体可为过40目筛。所述甲醇水溶液具体可为体积浓度30％的甲醇水溶液。所述超声提取在室温下进行。所述超声提取可进行多次，具体可为2次。每次超声提取的时间可为30min。所述离心的条件可为12000g离心10min。所述过滤可为经0.2μm微孔滤膜过滤。所述对照品为：1F-果呋喃糖基耐斯糖、D(+)葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖以及耐斯糖，纯度均≥98％。上述方法步骤2)中检测的实验条件如下：色谱条件：色谱柱：AcquityUPLCBEHAmideC18(2.1x100mm，1.7μm)；流动相A：80％乙腈水溶液(v/v，含0.1％氨水)，流动相B：30％乙腈水溶液(v/v，含0.1％氨水)；洗脱梯度：0～0.5min(0→0A，即洗脱液是100％的流动相B)，0.5～2.0min(0→10％A)，2.0～2.5min(10％→13％A)，2.5～9.0min(18％→34％A)，9.0～14min(34％→50％A)，14～16min(50％→60％A)，16～18min(60％→60％A)；柱温35℃；流速：200μL·min-1；进样量：1.0μL。质谱条件：数据采集模式：负离子(ESI-)条件下采用Continuum模式，用碘化钠校正质量范围50-2500Da；毛细管电压：2.0KV；锥孔电压40V，电离源温度110℃，脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速900L/h；低能量通道碰撞能量为6eV，高能量扫描碰撞能量为30～50eV。巴戟天低聚糖成分的质谱信息如下：表1巴戟天低聚糖成分的质谱信息注：*为巴戟天低聚糖[M─2H]2─本专利技术采用UPLC-QTOF/MS方法，快速地对巴戟天低聚糖成分进行全面表征，通过谱图解析，确定了19种巴戟天低聚糖的结构，为巴戟天药材创新性开发利用研究提供了科学依据。附图说明图1为巴戟天提取物的UPLC-Q-TofMS总离子流(TIC)色谱图。图2为利用UNIFY软件处理的巴戟天中菊粉型低聚糖3D离子流色谱图。图3为巴戟天菊粉型低聚糖结构简式。图4为巴戟天样品中蔗糖、蔗果三糖和耐斯糖的质谱图及其与相应对照品质谱图。图5为1F-果呋喃糖基耐斯糖的质谱图，其中A为高能量质谱图，B为低能量质谱图。图6为峰8的质谱图，其中A为高能量质谱图，B为低能量质谱图。图7为峰15的质谱图，其中A为低能量质谱图，B为高能量质谱图，C为部分放大的高能量质谱图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.材料1.1样品巴戟天样品(巴戟天的肉质根)采集于广东郁南，经中国中医科学院郝近大研究员鉴定为茜草科科植物MorindaofficinalisHow，原植物标本现保存于中国中医科学院中药资源中心。1.2仪器AcquityUPLC-I-Class串联Xevo-G2-SQ-TOF质谱联用仪，配有Masslynx4.1质谱工作站(Waters公司，美国)，分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，离心机(Eppendorf公司，德国)，KQ-100DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，0.2μm注射器式滤器(Pall公司，美国)。1.3试剂色谱级乙腈、甲醇(Merck公司，德国)；氨水(色谱级，德国Merck公司)；超纯水为Milli-Q纯水系统制备(电阻≥18.2MΩ，Millipore公司，美国)1.4对照品1F-果呋喃糖基耐斯糖(批号11965-201501，购自中国食品药品检定研究院)；D(+)葡萄糖(批号W-F012-150730)，蔗糖(批号Z-F038-160715)，蔗果三糖(批号Z-F005-151203)，耐斯糖(N-F016-150617)，北京融城鑫德科技有限公司提供，以上对照品纯度≥98％。2.方法2.1样品溶液及对照品溶液制备样品经干燥、粉碎，过40目筛，精密称取0.1g，加2.0mL30％甲醇水溶液(V/V)，室温超声提取2次，每次30min，12000g离心10min，取上清液经0.2μm微孔滤膜过滤，备用。分别精密称取适量对照品，加甲醇(30％甲醇水溶液(V/V))超声溶解，4℃避光保存，备用。2.2实验条件2.2.1色谱条件色谱柱为AcquityUPLCBEHAmideC18(2.1x100mm，1.7μm)；流动相A：80％乙腈水溶液(v/v，0.1％氨水)，流动相B：30％乙腈水溶液(v/v，0.1％氨水)；洗脱梯度：0～0.5min(0→0A)，0.5～2.0min(0→10％A)，2.0～2.5min(10％→13％A)，2.5～9.0min(18％→34％A)，9.0～14min(34％→50％A)，14～16min(50％→60％A)，16～18min(60％→60％A)，柱温35℃，流速：200μL·min-1，进样量：1.0μL。2.2.2质谱条件数据采集模式：负离子(ESI-)条件下采用Continuum模式，用碘化钠校正质量范围50-2500Da；毛细管电压：2.0KV；锥孔电压40V，电离源温度110℃，脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速900L/h；低能量通道碰撞能量为6eV，高能量扫描碰撞能量为30～50eV。2.3数据处理建立了巴戟天低聚糖的化合物库，导入UNIFY1.7软件中，进行峰提取和自动匹配鉴定低聚糖，并与对照品的色谱和质谱信息进行比对，确证所匹配化合物的结构以及其相应碎片特征，同时，根据文献报道的巴戟天低聚糖相关数据，鉴定巴戟天低聚糖成分，并进行结构确认。3.结果与分析3.1实验条件优化为全面表征巴戟天药材的低聚糖成分，通过比较以纯水、不同浓度甲醇及乙醇为提取溶剂时，提取物的色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法，包括下述步骤：1)制备样品溶液及对照品溶液：将巴戟天的根干燥、粉碎、过筛，用甲醇水溶液超声提取，离心，收集上清液，将上清液过滤，得到样品溶液，备用；用甲醇水溶液将对照品溶解，得到对照品溶液，备用；2)采用UPLC‑QTof/MSE进行检测，根据检测结果，确定巴戟天低聚糖成分。

【技术特征摘要】
1.一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法，包括下述步骤：1)制备样品溶液及对照品溶液：将巴戟天的根干燥、粉碎、过筛，用甲醇水溶液超声提取，离心，收集上清液，将上清液过滤，得到样品溶液，备用；用甲醇水溶液将对照品溶解，得到对照品溶液，备用；2)采用UPLC-QTof/MSE进行检测，根据检测结果，确定巴戟天低聚糖成分。2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于：步骤1)中，所述甲醇水溶液为体积浓度30％的甲醇水溶液；所述超声提取在室温下进行；所述超声提取进行多次；每次超声提取的时间为30min；所述对照品为：1F-果呋喃糖基耐斯糖、D(+)葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖以及耐斯糖，纯度均≥98％。3.根据权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于：步骤2)中检测的实验条件如下：色谱条件：色谱柱：AcquityUPLCBEHAmideC18(2.1x100mm，1.7μm)；流动相A：80％乙腈水溶液，v/v含0.1％氨水，流动相B：30％乙腈水溶液，v/v，含0.1％氨水；洗脱梯度：0～0.5min(0→0A)，0.5～2.0min(0→10％A)，2.0～2.5min(10％→13％A)，2.5～9.0min(18％→34％A)，9.0～14min(34％→50％A)，14～16min(50％→60％A)，16～18min(60％→60％A)；柱温35℃；流速：200μL·min-1；进样量：1.0μL；质谱条件：数据采集模式：负离子(ESI-)条件下采用Continuum模式，用碘化钠校正质量范围50-2500Da；毛细管电压：2.0KV；锥孔电压40V，电离源温度110℃，脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速900L/h；低能量通道碰撞能量为6eV，高能量扫描碰撞能量为30～50eV。4.根据权利要求1-3中任一项所述的鉴别方法，其特征在于：保留时间9.98min；m/z341.1078；Neutralmass(Da)342.1162；Adducts-H,+HCOO；高能量碎片(-)(m/z)323.0965,267.0703,249.0596,179.0542,143.0332,113.0228,101.0229,89.0229,71.0126对应的物质为蔗糖，其分子式为C12H22O11；保留时间11.39min；m/z503.1614；Neutralmass(Da)504.1690；Adducts-H,+HCOO；高能量碎片(-)(m/z)485.1421,341.1068,325.0255,179.0208,143.0332,113.0228,101.0229,89.0229,71.0126对应的物质为蔗果三糖，其分子式为C18H32O16；保留时间12.23；m/z665.2175；Neutralmass(Da)666.2218；Adducts+HCOO,-H,-H+HCOO；高能量碎片(-)(m/z)711.2206,485.1415,323.0914,247.0199,179.0575,101.0320,71.0250对应的物质为耐斯糖，其分子式为C24H42O21；保留时间12.90；m/z827.2668；Neutralmass(Da)828.2747；Adducts-H,+HCOO,-H+HCOO；高能量碎片(-)(m/z)873.2729,647.2053,485.1439,341.1040,323.0952,179.0577,113.0305,101.0328对应的物质为1F-果呋喃糖基耐斯糖，其分子式为C30H52O26；保留时间13.45；m/z989.3193；Neutralmass(Da)990.3275；Adducts-H,+HCOO,-H+HCOO；高能量碎片(-)(m/z)809.2558,647.2033,485.1503,341.1075,323.0970,179.0544对应的物质为菊粉型六糖，其分子式为C36H62O31；保留时间13.98；m/z1151.3723；Neutralmass(Da)1152.3803；Adducts-H,+HCOO,-2H；高能量碎片(-)(m/z)989.3854,971.3716,809.2932,647.2025,485.1496,341.1069,179.0541对应的物质为菊粉型七糖，其分子式为C42H72O36；保留时间14.44；m/z1313.4275；Neutralmass(Da)1314.4332；Adducts-H,+HCOO,-2H；高能量碎片(-)(m/z)1133.3635,989.3191,809.2565,647.2028,485.1499,341.1075,179.0545对应的物质为菊粉型八糖，其分子式为C48H82O41；保留时间14.88；m/z1475.4813；Neutralmass(Da)1476.4860；Adducts-H,+HCOO,-2H；高能量碎片(-)(m/z)1295.4185,1151.3735,1133.3632,971.3093,809.2560,737.2364,485.1511,341.1079,179.0545对应的物质为菊粉型九糖，其分子式为C54H92O46；保留时间15.30；m/z1637.5283；Neutralmass(Da)1638.5388；Adducts-H,+HCOO,-2H；高能量碎片(-)(m/z)1457.4706,1313.4291,971...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，郝庆秀，郭兰萍，康利平，朱寿东，余意，胡明华，马方励，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，无限极中国有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11