一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法技术

本发明专利技术涉及一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶(thrombin)的荧光检测方法，提供了一种基于核酸适配体和PEI‑Fe3O4检测凝血酶浓度的新型生物传感器，其中寡核苷酸带负电荷，PEI‑Fe3O4富含氨基而带正电，在缓冲液中，荧光标记的核酸适配体与PEI‑Fe3O4因静电引力而吸附到Fe3O4的表面而使荧光猝灭。在核酸适配体/PEI‑Fe3O4复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配体结合从而使其远离PEI‑Fe3O4的表面，荧光得以恢复。所以，通过荧光值的变化，可以检测出凝血酶的浓度，本发现只需要改变核酸适配体的序列，就可以实现对其他底物分子的检测，在凝血酶检测领域具有重大的研究和应用意义。

A fluorescence detection method using nucleic acid aptamers and magnetic materials for detecting thrombin

The invention relates to a magnetic material aptamer and thrombin detection by nucleic acid (thrombin) fluorescence detection method, provides a novel aptamer biosensor for thrombin detection concentration of ligand and PEI based on Fe3O4, the oligonucleotide with negative charge, PEI Fe3O4 rich in amino and positively charged, in buffer, nucleic acid fluorescence labeled aptamer and PEI Fe3O4 due to electrostatic attraction and adsorbed onto the surface of Fe3O4 and the fluorescence quenching. In addition of thrombin aptamer ligand /PEI Fe3O4 composites, surface and thrombin binding aptamers to PEI from Fe3O4, fluorescence recovery. Therefore, the concentration of thrombin can be detected by the change of fluorescence value. We found that only by changing the sequence of aptamers, we could detect other substrate molecules and have significant research and application significance in the field of thrombin detection.

【技术实现步骤摘要】
一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法
本专利技术属于生物化学领域，涉及纳米技术，尤其是一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法。
技术介绍
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血液凝固、炎症、贫血、创伤愈合等生理及病理过程中发挥着重要作用，其含量是凝血机制的重要指标。同时，凝血酶还可以作为相关疾病诊断的生物标识物。因此，建立简单、快速、高灵敏度检测凝血酶的方法对临床疾病的早期诊断、病程发展、疗效的监测和评估等都具有非常重要的意义。传统检测凝血酶的方法有高效液相色谱、生物质谱法、蛋白印迹法、酶联免疫吸附分析等方法。基于色谱以及质谱技术的定量分析方法由于所用仪器昂贵、对操作者技术要求高从而缩小了其应用范围。基于免疫反应的分析方法是应用比较广泛的技术，但也存在着一些局限性，如抗体本身稳定性差(高温易失活)、抗体标记难以精确化等缺点限制了该类检测方法的应用。核酸适配体是一类新的具有与抗体类似的识别功能的分子，它的出现为蛋白质分析带来了新的机遇和希望。近年来利用适配体作为识别分子用来建立凝血酶的检测方法逐渐被发现。利用适配体检测凝血酶的主要围绕在以光学、电化学、以及与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：包括如下方法步骤：(1)PEI‑Fe3O4的制备：所述PEI‑Fe3O4由共沉淀方法制得；(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI‑Fe3O4形成的复合物作为生物检测器，具体操作步骤如下：步骤1：选择三种不同荧光FAM、TAMRA、HEX标记的三条随机寡核苷酸链和6‑FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3和Free FAM dye，其中，Free FAM dye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机链和同浓度的6‑FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录；步骤2：将PEI‑Fe3O4加入到步骤...

【技术特征摘要】
1.一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：包括如下方法步骤：(1)PEI-Fe3O4的制备：所述PEI-Fe3O4由共沉淀方法制得；(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe3O4形成的复合物作为生物检测器，具体操作步骤如下：步骤1：选择三种不同荧光FAM、TAMRA、HEX标记的三条随机寡核苷酸链和6-FAM，分别为Random1、Random2、Random3和FreeFAMdye，其中，FreeFAMdye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机链和同浓度的6-FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录；步骤2：将PEI-Fe3O4加入到步骤1溶液中，PEI-Fe3O4作为固相载体因静电作用吸附自由卷曲状态的寡核苷酸链；步骤3：选择FAM标记的凝血酶适配体，在凝血酶适配体/PEI-Fe3O4复合物中加入凝血酶待测物进行反应；步骤4：在含有50nM凝血酶适配体/PEI-Fe3O4的复合物中加入凝血酶，并检测加入前后荧光值的变化，再加入300nM的凝血酶检测荧光值变化；(3)核酸适配体/PEI-Fe3O4复合物对thrombin的选择性试验及对凝血酶(thrombin)和溶菌酶(lysozyme)的双通道检测试验，其中所用thrombin和lysozyme的浓度均为100nM。2.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：所述PEI-Fe3O4的制备采用经纯化和去氧的1.3M的FeCl3﹒6H2O和0.65M的FeCl2﹒4H2O在搅拌的条件下溶解在水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调节pH，配制pH10的月桂酸用于包被，在N2保护下，将溶解在50％甲醇中的8％的PEI加入其中，80℃搅拌1.5h，所得修饰过的Fe3O4溶液分别用无水乙醇和超纯水清洗3次，最后将其溶解在20mM的pH7.4的Tris-HCl中放于4℃保存。3.根据权利要求2所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：所制备的PEI-Fe3O4纳米粒子进行TEM、DLS、XRD以及磁化强度表征，纳米粒子的粒径为10nm，水和粒径为77.9±0.18nm，Zeta电位为20.5±1.21mV。4.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：三条随机DNA链序列：Randon1：5’-FAM-AAAAATTATACGCGATGCGATGCGAATTAACTCAC-3’Random2：5’-TAMRA-TTAATTTCGCTTTTTGCGCGCAAAATTTTT-3’Radom3：5’-HEX-...

【专利技术属性】
技术研发人员：马龙，刁爱坡，满淑丽，孙娜娜，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12