用等温分支扩增检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒及方法技术

提供一种用等温分支扩增（ＲＡＭ）检测对虾白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的试剂盒，特别是提供一对检测ＷＳＳＶ特异性标记探针，进一步提供一种使用该试剂盒检测ＷＳＳＶ的方法；试剂盒包括ＤＮＡ提取试剂、杂交液Ｃ、探针捕获试剂、洗涤液Ｆ、连接液Ｇ、等温分支扩增（ＲＡＭ）反应液Ｈ、显色剂Ｉ；检测ＷＳＳＶ的方法包括（１）ＷＳＳＶ的ＤＮＡ提取，（２）ＷＳＳＶ的等温分支扩增，（３）显色检测。本发明专利技术采用ＲＡＭ技术，特异性强，与ＰＣＲ检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的ＰＣＲ仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于对虾各生长发育阶段的ＷＳＳＶ检测。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用等温分支扩增方法检测对虾白斑综合症病毒的试剂盒，其试剂包括：（１）ＤＮＡ提取试剂：含组织裂解液Ａ和ＤＮＡ吸附液Ｂ；组织裂解液Ａ含有４Ｍ异硫氰酸胍、２５ｍＭ柠檬酸钠、０．５％十二烷基肌氨酸钠和０．１Ｍ的β－巯基乙醇； ＤＮＡ吸附液Ｂ为５０％吸附磁珠悬浮液；（２）杂交液Ｃ：杂交液Ｃ含有２Ｍ异硫氰酸胍、０．５％牛血清白蛋白、８０ｍＭ乙二胺四乙酸、４００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、０．５％十二烷基肌氨酸 钠、２－１０ｎＭＷＳＳＶ－Ｃ－探针和２０－１００ｎＭＷＳＳＶ－捕获探针；（３）探针捕获试剂：包括磁珠Ｄ和探针捕获液Ｅ；磁珠Ｄ是浓度为４ｍｇ／ｍｌ的链亲和素免疫磁珠；探针捕获液Ｅ含有１０ｍＭｐＨ７．５的三羟 基甲基氨基甲烷－盐酸、１ｍＭ乙二胺四乙酸和１－２ＭＮａＣｌ；（４）洗涤液Ｆ：含有１０ｍＭｐＨ８．０的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸和１ｍＭ乙二胺四乙酸；（５）连接液Ｇ：含有１×连接液缓冲液和１０－２０活性单位的ＴａｑＤＮＡ 连接酶；１×连接酶缓冲液含有２０ｍＭｐＨ７．６的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、２５ｍＭＫＡｃＯ、１０ｍＭＭｇＡｃＯ、１０ｍＭ二硫苏糖醇、１ｍＭ二氢尿嘧啶脱氢酶和０．１％曲拉通Ｘ－１００；（６）等温分支扩增反应液Ｈ：含有１０× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、２００－１０００ｕＭｄＮＴＰ、０．８－１．５ｕＭ正向引物Ｐｒｉｍｅ－１、０．８－１．５ｕＭ反向引物Ｐｒｉｍｅ－２、５－１５ＵＢｓｔＤＮＡ聚合酶和５０－２００ｎｇＴ４噬菌体基因３２编码蛋白；１０× Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍＭｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］、２０ｍＭＭｇＳＯ↓［４］和１％曲拉通Ｘ－１００；（７）显色剂Ｉ：为１％的荧光染 料ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩ；其中杂交液Ｃ中的ＷＳＳＶ－Ｃ－探针序列为：５’－磷酸－ＧＧＧＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡ ＴＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＧＧＡＴＡＡＴＡＴ；杂交液Ｃ中的ＷＳＳ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任春华，胡超群，沈琪，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]