一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，它涉及一种检测李斯特菌的方法。本发明专利技术解决了现有检测单增李斯特活菌的方法容易产生假阳性的问题。本发明专利技术检测单核细胞增生李斯特菌的方法按如下步骤进行：从待测物品中提取菌泥后提取ＲＮＡ进行反转录及实时ＰＣＲ；即得到可以判断待测物品是否含有单增李斯特活菌的图谱。本发明专利技术具有灵敏度高，特异性好，操作简便，周期较短的优点，适应食品工业中致病菌快速检测的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测李斯特菌的方法。技术背景单核细胞增生(增多性)李斯特菌a/Wen'o附o"oc^oge"es， Lm)，简 称单增李斯特菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，其pH值生长范围为 4.39~9.40，在4'C下也可生长，因此增加了对冷藏食物的危害性。单增李斯 特菌广泛存在于土壤、动物和水产品中，主要通过乳及乳制品、蔬菜、水产 品、肉制品等食物传播。因其具有独特的生理特性，能引起人类脑膜炎、败 血症等疾患，尤以妊娠期妇女、新生儿以及免疫功能低下的病人更易感染， 致死率达30%以上。现有检测单增李斯特菌的方法全过程至少需要4~7天，检出限度不够灵 敏，操作复杂，费时费力。而PCR和探针杂交都无法排除死菌和活菌，由于 死菌中的DNA降解较慢，也容易产生假阳性。检测技术的假阳性会带来错 误的信息和判断，根据假阳性结果所采取的措施可能会带来不必要的损失。 荧光染料(EMA)与PCR技术相结合可以对活菌进行检测，其原理是EMA 可通过被破坏的细胞膜与DNA相结合，而结合了 EMA的基因组DNA在 PCR反应中不能进行扩增；反之，EMA不能通过活菌的细胞膜，所以不能 与基因组DNA相结合，PCR反应可正常进行。但有研究报告指出EMA可 穿透部分细菌活体的细胞膜，并与DNA双链结合，造成活菌基因组DNA 损失，所以PCR检测结果不准确。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有检测单增李斯特活菌的方法容易产生假阳性的问题，而提供。本专利技术的检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；二、 将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬 于lmL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡 旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min;三、 取离心后悬浮物700mL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于 1.5mL的环氧树脂管中，在68'C的条件下保温5min,然后在室温下以 14000r/min的速度离心4min;四、 取600^iL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂 管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min;五、 再取400nL上层水相与800nL的绝对乙醇和40nL、浓度为3mol/L 的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20。C保温lOmin，再以 16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；六、 用体积为lmL、质量浓度为70%的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min 的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。七、 将干燥的RNA重悬于20nLDEPC水中，加入DNA酶(DNaseI) 和RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)在37'C下保温15min，再放入60°C 的水浴10min;八、 RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为在95'C保温2min 后，在42""C保温15min; PCR反应参数为在95'C的条件下预变性10s, 40个循环中，每个循环均在95°C的条件下变性5s，在60°C的条件下延伸34s, 其中反转录及实时PCR的正向引物为5，-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3，， 反向引物为5'-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3，，荧光探针为 FAM-5'-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3'-TAMRA;通过荧光监测 系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软 件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。实时PCR反应试剂用量PCR扩增聚合酶(2x)PCR正向引物(10nM)0.4nLPCR反向引物(10nM)0.4|iL探针0.4jiLROXII (荧光染料)0单DNA模板2攀蒸馏水6单总体积20pL步骤七中的DEPC水是用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。步骤二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇:乙醚:氨水的体积比为1:1:1， 其中甲醇的浓度为10.4mol/L，乙醚的浓度为4.5mol/L，氨水的浓度为9.5 mol/Lo用本专利技术的方法检测单增李斯特菌，无假阳性反应，可以区分存活的李 斯特菌和死亡的李斯特菌，这是现有检测方法达不到的效果，本专利技术的检测 方法灵敏度最高达到样品增菌12小时检测限为17CFU/mL，检测全过程仅 需要16小时。附图说明图1为本专利技术的方法检测单增李斯特活菌阳性的曲线示意图；图2为具 体实施方式五的人工污染乳12小时李斯特活菌检测图。具体实施方式具体实施方式一本实施方式检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如 下步骤进行一、 取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养 培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以 14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；二、 将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬 于lmL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡 旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离 心3min;三、 取离心后悬浮物700pL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于 1.5mL的环氧树脂管中，在68。C的条件下保温5min，然后在室温下以 14000r/min的速度离心4min;四、 取600^L的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂 管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min;五、 再取400nL上层水相与800^iL的绝对乙醇和40jxL、浓度为3mol/L 的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-2(TC保温10min，再以 16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；六、 用体积为lmL、质量浓度为70%的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min 的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。七、 将干燥的RNA重悬于20iiLDEPC水中，加入DNA酶(DNaseI) 和RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)在37'C下保温15min，再放入60。C 的水浴10min;八、 RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为在95'C保温2min 后，在42°。保温15min; PCR反应参数为在95"C的条件下预变性10s， 40个循环中，每个循环均在95°C的条件下变性5s，在60°C的条件下延伸34s， 其中反转录及实时PCR的正向引物为5'-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3', 反向引物为5'-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3，，荧光探针为 FAM-5，-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3，-TAMRA;通过荧光监测 系本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行：一、取待测物品２５ｇ置于２２５ｍＬ胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养８小时，再取培养液４ｍＬ放于５ｍＬ环氧树脂管中，在室温下以１４０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心３ｍｉｎ，得到菌泥；二、将得到的菌泥重悬于３ｍＬ甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬于１ｍＬ的裂解液中，然后加入０．２ｇ、直径为０．２ｍｍ的玻璃珠，２０００转／分涡旋５ｍｉｎ。然后以１４０００ｒ／ｍｉｎ的相对离心力离心３ｍｉｎ；三、取离心后悬浮物７００μＬ与同体积ｐＨ值为５．５的水饱和酚混合于１．５ｍＬ的环氧树脂管中，在６８℃的条件下保温５ｍｉｎ，然后在室温下以１４０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心４ｍｉｎ；四、取６００μＬ的上层水相与同体积氯仿混合于另一个１．５ｍＬ的环氧树脂管中，以２０００ｒ／ｍｉｎ的速度涡旋２０ｓ后，再以１４０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心４ｍｉｎ；五、再取４００μＬ上层水相与８００μＬ的绝对乙醇和４０μＬ、浓度为３ｍｏｌ／Ｌ的醋酸钠混合，以２０００ｒ／ｍｉｎ的速度涡旋２０ｓ后，于－２０℃保温１０ｍｉｎ，再以１６０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎ获得ＲＮＡ沉淀物；六、用体积为１ｍＬ、质量浓度为７０％的乙醇洗涤沉淀物，以１６０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心３ｍｉｎ后，在室温下干燥至无乙醇残留。七、将干燥的ＲＮＡ重悬于２０μＬＤＥＰＣ水中，加入ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶抑制剂在３７℃下保温１５ｍｉｎ，再放入６０℃的水浴１０ｍｉｎ；八、ＲＮＡ抽提之后进行ＲＴ－ＰＣＲ操作，反转录条件为：在９５℃保温２ｍｉｎ后，在４２℃保温１５ｍｉｎ；ＰＣＲ反应参数为：在９５℃的条件下预变性１０ｓ，４０个循环中，每个循环均在９５℃的条件下变性５ｓ，在６０℃的条件下延伸３４ｓ，其中反转录及实时ＰＣＲ的上游引物为５’－ＴＧＣＡＡＧＴＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡ－３’，下游引物为５’－ＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＴＡＡ－３’，荧光探针为ＦＡＭ－５’－ＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＣＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＧ－３’－ＴＡＭＲＡ；通过荧光监测系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。实时ＰＣＲ反应试剂用量ＰＣＲ扩增聚合酶（２ｘ）１０μＬＰＣＲ正向引物（１０μＭ）０．４μＬＰＣＲ反向引物（１０μＭ）０．４μＬ探针０．４...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，闫冰，韩希妍，曲妍妍，王明娜，相丽，吕琦，毕宇涵，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[]
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