本发明专利技术公开了一种ＨＩＶ毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。本发明专利技术构建了表达ＨＩＶ Ｇａｇ蛋白的质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达ＨＩＶ Ｒｅｖ蛋白的辅助质粒。所述三种质粒和从毒株中扩增的ＨＩＶ逆转录酶和蛋白酶基因片段在辅助质粒ｐＶＳＶ－Ｇ的作用下可得到含有毒株的ＨＩＶ逆转录酶和蛋白酶基因的假型慢病毒。将该假型慢病毒感染哺乳动物细胞，即可得到基于报告基因的毒株耐药表型分析细胞模型。本发明专利技术的细胞模型可对毒株进行快速、安全的耐药表型分析，报告基因使该细胞模型具备极高的敏感性，该ＨＩＶ毒株耐药分析细胞模型适合于中国人群ＨＩＶ毒株的表型耐药分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，又称艾滋病毒，由 HIV感染而引起的疾病称为艾滋病，全称为获得性免疫缺陷综合征(acquired i腿unodeficiency syndrome, AIDS)，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+ 细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、 病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。HIV的流行呈世界性分 布，非洲为HIV的发源地和重灾区，欧洲和美洲也为主要流行区，近年HIV在亚洲的 流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者，至今已有60 80万人 发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30%的增 长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的 感染率达总人口 30%以上。因此，预防和治疗艾滋病，已不仅仅是挽救个人生命的问 题，而是关系到民族存亡的大事。HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)， 目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。 HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到，毒力和传播 力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是 引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。艾滋病病毒(HIV)颗粒呈球形，直径90 nm 130nm。病毒的核心呈中空锥形， 由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成。核心之外为病毒衣壳，呈20面 体立体对称，含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜，包膜上的糖蛋白有刺突状结构，是 HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点。HIVRNA中含有gag、 env和pol基 因以及6种调控基因〔tat， vif， vpr， vpx (vpu)， nef， rev〕 。 gag基因编码病毒 的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需要的酶类(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)； erw基因所编码的病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。HIV主要侵犯人体的CD4+ T淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸附、 侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时，病毒的外膜糖蛋白gpl20首先与细胞表面的CD4分子结合并与辅助受体CCR5或CXCR4等结合，gpl20 空间构象发生改变，暴露出跨膜蛋白gp41与细胞膜作用，导致病毒包膜与细胞膜融 合，病毒核心进入细胞内，脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模板合成cDNA， 再以此cDNA为模板合成双链DNA，在病毒整合酶IN的作用下随机整合到细胞染色体 上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞。该前病毒即为病毒复制时 的转录模板，病毒进行复制时，早期转录的长链mRNA经剪接后表达病毒的调节蛋白， 待调节蛋白的量到达一定阈值后，病毒进入晚期转录，产生的未拼接的mRNA部分用 来指导合成病毒的结构蛋白，部分作为病毒的基因组，与结构蛋白进行装配成为病毒 核心颗粒，由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白。抗HIV药物的大量应用导致了耐药性问题出现，因此建立快速、高效、低成本的 HIV毒株耐药分析技术为当前急需解决的关键问题。目前进行HIV毒株耐药分析的方法 主要有两种 一种是测定毒株的核苷酸序列，与HIV耐药突变数据库进行比对，从而 预测毒株是否产生耐药性，这种方法即基因型耐药分析方法，具有一定的指导意义， 但是不够准确；另外一种是表型耐药分析方法，即通过耐药实验检测毒株对某种药物 的抗性，该方法结果准确，但是操作复杂，周期长，往往需要分离病毒，并且HIV的 分离培养并不是件容易的事情，成功率不太高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供HIV毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒。 本专利技术提供了一种表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒。 所述表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒可为表达HIV的Gag基因同时 缺失其蛋白酶-逆转录酶的重组表达质粒，具体可为图1所示的pGag。本专利技术还提供了一种混合质粒，包括表达HIV的Gag基因的重组表达质粒和表达 报告基因的重组慢病毒质粒。所有常规报告基因均可使用，如荧光素酶基因(包括萤火虫荧光素酶和海洋腔肠 荧光素酶)，荧光蛋白基因(包括绿色荧光蛋白及其各种衍生物，红色荧光蛋白等)， 氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)， e-半乳糖苷酶基因(e-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶基因 (GUS)。所述混合质粒还可包括表达HIV的Rev基因(rev)的重组表达质粒和表达疱疹性 口炎病毒壳G糖蛋白(VSV外膜糖蛋白)基因的重组表达质粒。所述表达HIV的Gag基因(gag)的重组表达质粒可为表达HIV的Gag基因同时 缺失其蛋白酶-逆转录酶的重组表达质粒，具体可为图l所示的pGag;所述表达报告 基因的重组慢病毒质粒具体可为图2所示的pLenti-Luc;所述表达HIV的Rev基因的重组表达质粒具体可为图3所示的pRev;所述可表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因 的重组表达质粒具体可为pVSV-G。本专利技术还提供了一种假型慢病毒，是通过如下方法得到的将所述混合质粒和如 下DNA片段共转染哺乳动物细胞，得到假型慢病毒；所述DNA片段是含有HIV逆转录 酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段；所述哺乳动物细胞为HEK 293细胞、93T细胞、 293FT细胞或Hela细胞。所述含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段可以以待进行耐药表型 分析的毒株为模板用如下引物进行扩增得到外引物PRRT-0UT5B : 5' -AGCAATGAGCCAAG(T/C)AACAA-3，； PRRT-0UT3B : 5' -TTTGTGTGCTGG(T/C)ACCCAT-3'。 内引物PRRT-IN5B : 5' -GTACTGAGAGACAGGTAAT-3，； PRRT-IN3B : 5' -TGTTGT(G/C)TCAGTTAGGGTGA-3'。 以上引物是根据中国株HIV序列设计的。 含有所述假型慢病毒的细胞也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了一种HIV毒株耐药分析细胞模型，是用所述假型慢病毒感染的哺 乳动物细胞；所述哺乳动物细胞优选HEK 293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela 细胞。所述假型慢病毒、所述细胞模型均可应用于HIV毒株耐药表型分析。 当采用上述根据中国株HIV序列设计的引物扩增所述含有HIV逆转录酶基因和HIV蛋白酶基因的DNA片段时，HIV毒株耐药表型分析细胞模型适合于中国人群HIV毒株的表型耐药分析。本专利技术构建了表达HIV Gag蛋白的辅助质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和 表达HIV的Rev基因的重组表达质粒。将上述3种质粒、pVSV-G质粒和从病人体内扩增 的含有HIV逆转录酶和HIV蛋白酶基因片段共转染哺乳动物细胞，基因片段在共转染细 胞内与缺失的HIV本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达ＨＩＶ的Ｇａｇ基因的重组表达质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：童贻刚，李敬云，张昕，安小平，周育森，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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