本发明专利技术提供TRPC5的一种新用途，即：TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用，所述药物为TRPC5抑制剂，包括TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6-TRPC5-DN和Lenti-TRPC5-DN、TRPC5的SiRNAsiC5，所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明专利技术的重要之处是发现了TRPC5与介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白表达密切相关，以及TRPC5抑制剂对体外和体内肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，因此，本发明专利技术为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及TRPC5的一种新用途，尤其涉及瞬时受体电位通道TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术介绍
肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞接触某种抗肿瘤药物后，不仅对该药物产生耐药性，而且对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低了抗肿瘤药物的疗效。多年来研究者发现了多种MDR产生机制，其中，由多药耐药基因MDRl编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P_gp)是目前研究最多也是最为重要的多药耐药相关蛋白。P-gp在肿瘤组织中总体表达水平较低，但在恶性肿瘤中有却有一定水平的表达，尤其是在耐药肿瘤组织中其表达量明显上调。P-gp的功能可归如下一方面，P-gp是一种细胞膜ATP依赖泵，可结合并以耗能的方式排出多种药物，从而降低细 胞内药物浓度，使其产生耐药性；另一方面，P-gp可能是钙离子通道的一部分，钙通道阻滞剂和一些钙调蛋白抑制剂均可与P-gp结合，通过屏蔽P-gp来提高细胞内的药物浓度，从而增加多药耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。P-gp主要介导亲脂性抗肿瘤药物引起的MDR，包括抗生素类如多柔比星/阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)，植物类药物如长春新碱(VCR)、依托泊苷(Vp216)等。到目前为止设计和筛选出的肿瘤MDR逆转剂大多以P-gp作为靶点，主要包括以下三代 (1)第一代逆转剂维拉帕米和环孢菌素A 维拉帕米和环孢菌素A是被最早被发现的可在体外抑制MDRl介导MDR的药物，但其在临床上出现的剂量依赖性副作用严重限制了它们的应用； (2)第二代逆转剂dex_维拉帕米、valsodar (PSC833)、bricoda (VX-710) 比第一代逆转剂的逆转活性更强，但该类逆转剂能同时抑制P-gp介导的胆汁排泄和肠道转运，并与抗肿瘤药物竞争性结合细胞色素P-450，从而抑制药物的肝肠代谢，导致抗肿瘤药物的毒性增大。(3)第三代逆转剂Tariquidar (XR9576)> Zosuquidar (LY335979)> Laniquidar(R101933) 第三代逆转剂通过直接与P-gp结合，使其丧失外排抗肿瘤药物的功能，从而逆转多药耐药，但该类逆转剂仍处于临床试验阶段，尚不成熟。综上所述，目前大部以P-gp为作用靶点的MDR逆转剂都具有严重的毒副作用，因而阻碍了它们的临床应用，因此，寻找新的肿瘤耐药相关靶点，并在此基础上设计筛选出高效低毒的多药耐药逆转剂亟不可待。瞬时受体电位通道(transientreceptor potential channels, TRP 通道)是位于细胞膜的一类非常重要的非选择性阳离子(主要为钙离子和钠离子)通道，最早被发现于果蝇视觉系统，在哺乳动物，已发现28种TRP通道亚型，分属于6个亚家族TRPC、TRPV、TRPM、TRPA, TRPP和TRPML，其调节机制各异，涉及功能广泛，参与多种疾病的病理生理过程。其中，TRPC (Cannonical TRP)，即传统型TRP通道，包括TRPC1-7共七个亚型，主要参与细胞膜受体激活磷脂酶C后所介导的钙离子进入。TRPC5主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘，并主要参与生长锥的形成和脑的发育，近几年来研究表明很多TRP通道均参与细胞的生存、增殖和死亡等基本生命活动，随着研究的深入，有理由相信TRP通道将会参与更多疾病的病理生理过程。目前，国内外未见有TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述的缺陷，本专利技术的目的在于提供TRPC5的一种 新用途，即TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。所述药物为TRPC5抑制剂，包括TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的SiRNA或TRPC5的显性抑制质粒，其中，所述TRPC5的显性抑制质粒包括 PCDNA6-TRPC5-DN、Lenti-TRPC5_DN。所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本专利技术的有益技术效果为 经本专利技术人研究发现，与敏感型肿瘤细胞(如MCF-7/WT)相比，瞬时受体电位通道TRPC5在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中有更高水平的表达，且该通道具有通透钙离子的生理活性，并与介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白表达密切相关，能间接上调P-gp蛋白的表达水平；实验表明，TRPC5抑制剂(TRPC5的药理学拮抗剂2-APB、TRPC5的阻断型抗体T5E3、TRPC5的显性抑制质粒pCDNA6_TRPC5_DN、TRPC5的SiRNA siC5)对体外和体内肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用；因此，本专利技术为抗肿瘤多药耐药新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。附图说明图I为本专利技术实施例I中多药耐药肿瘤细胞中TRPC5的表达水平及其钙离子通透活性的检测结果示意图。图2为本专利技术实施例2中TRPC5与P_gp表达水平的关系检测结果示意图。图3为本专利技术实施例3中TRPC5抑制剂对体外肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。图4为本专利技术实施例4中TRPC5抑制剂对体内肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。具体实施例方式以下结合附图，并通过实施例对本专利技术进行具体说明。以下实施例所使用实验材料如下 细胞系野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库(ATCC);耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存，其制备方法为将新复苏的野生型MCF-7/WT细胞(购自ATCC)于细胞培养常规条件下培养2代 3代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，加药第二天后再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 u g/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月。质粒TRPC5的显性抑制质粒PCDNA6-TRPC5-DN由美国哈佛大学教授D. E.Clapham 赠送(该质粒还可通过文献(Shang-Zhong Xu, Katsuhiko Muraki, et al. A Sphingosine-l-Phosphate-Activated Calcium Channel Controlling Vascular SmoothMuscle Cell Motility . Cellular Biology, 2006，1381-1389)所述方法制备得到)；pCDNA6购自美国Addgene公司；Lenti-TRPC5_DN和Lenti-GFP由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存。上述Lenti-TRPC5-DN的制备方法为将TRPC5-DN基因(由美国哈佛大学教授D. E. Clapham赠送，其制备方法同上文文献中所述TRPC5-DN基因的制备方法)克隆至慢病毒载体pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-sin (购自美国invitrogen公司)中，与包装质粒(包括pLPl, pLP2, pLP/V本文档来自技高网...
【技术保护点】
TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，马鑫，陈蕴，蔡燕飞，何冬旭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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