制备7-ACA和7-ADAC的新的生物方法技术

由一种新的生物方法制备用于生产头孢菌素抗菌素，７－氨基－头孢菌烷酸（７－ＡＣＡ）和７－氨基去乙酰基头孢菌烷酸（７－ＡＤＡＣ）的重要中间产物，其中在己二酸盐原料存在下培养已转化的产黄青霉菌菌株从而产生己二酰－６－ＡＰＡ（６－氨基青霉菌烷酸）；然后由转化了下列基因的产黄青霉菌在原位表达这些基因：１）一种扩展酶基因，２）一种羟基化酶基因，３）一种酰基转移酶基因。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备商品头孢菌素抗菌素的合成方法的领域，头孢菌素目前有相当数量的品种，这些治疗药物目前正处于其第四代产品。由于商品头孢菌素中存在各种各样的侧链以及头孢菌素具有的显著的经济价值，获得制备关键性中间产物的更经济和更有效的方法变得越来越重要，这些关键性中间产物便于迅速合成各种头孢菌素。这些关键性中间产物之一是7-氨基-头孢菌烷酸(7-ACA)，可用下列通式表示 目前，7-ACA是从头孢菌素C制备的。头孢菌素C本身是一种发酵产物，它几乎是目前市场上销售的所有头孢菌素的起始点。但是，在大多数情况下生产这些各种类型的商品头孢菌素的合成操作过程基本上是由7-氨基头孢菌烷酸开始的，从头孢菌素C上裂解7-氨基己二酰侧链可以衍生得到7-氨基头孢菌烷酸。典型的头孢菌素是从7-ACA合成得到的，因而它具有3-乙酰甲醛侧链，包括头孢氨噻，氨基苯乙酰头孢菌素，先锋霉素I，吡啶硫乙酰头孢菌素。另一种关键性中间产物是7-氨基脱乙酰基头孢菌烷酸(7-ADAC)，可用下列通式表示 目前，7-ADAC也是通过移走7-D-α-氨基己二酰侧链，并将3-乙酰基甲醛侧链转变为3-羟甲基而从头孢菌素C制备的。在合成含有在C-3位置进行修饰取代的头孢菌素时7-ADAC是一种有用的中间化合物。现在，本领域内技术人员选择化学方法用于裂解7-氨基己二酰侧链。基本的亚氨基-卤化物方法需要将7-氨基己二酰侧链上的氨基和羧基团封闭，并且目前已用几种方法完成这一过程。但是，正如目前使用的，化学裂解方法有严重的不足。这些缺点是需要多个步骤并且方法复杂，非常低的操作温度，昂贵的试剂，该方法产生大量的副产物导致污物处理问题，以及在化学处理开始前对高度不纯的起始材料进行纯化。因此，需要不断地探索一种微生物学或发酵方法，该方法要比目前使用的化学方法能更经济地实现对头孢菌素进行酶促脱酰基从而得到7-氨基头孢菌烷酸。但是，已有大量事实证明探索一种成功的微生物方法的工作没有取得成效。正如在文献中清楚地描述，这是由于头孢菌素C的氨基己二酰侧链的结构，尤其是立体化学结构造成的，尽管利用各种各样的微生物产生的青霉素转酰酶进行酶促裂解已成功地将青霉素进行脱酰基化。另一方面，在文献中报道的成功的头孢菌素C的一步法酶促脱酰基化反应经常是不能重复的或者仅能得到十分有限的产量。因此，本专利技术特别涉及制备关键性头孢菌素中间产物7-ACA的领域，更具体地说，属于制备7-ACA的生物方法的领域。至今，已证明探索制备7-ACA的成功的生物方法的工作没有成效，当然是指一种商业规模方法。例如，如果通过直接发酵和/或酶促处理青霉素G可以制备6-氨基青霉菌烷酸(6-APA)，从而只需要进行环扩展即能得到7-ADCA，不幸的是已发现在这些微生物的正常的代谢途径中执行环扩展的头孢霉菌和链霉菌的酶不接受6-APA作为底物。在本领域中将这些酶统称为DAOCS或延伸酶，该酶的定义是能够催化青霉素型分子中存在的penam环结构扩展为Ceph-3-em环，如在头孢菌素中存在的环结构。在下文中，将这些酶统称为“延伸酶”。延伸酶作用的底物是青霉素N，该底物进行环扩展并羟基化，得脱乙酰基头孢菌烷酸(DAC)。这里，只需切割(D)-α-氨基己二酰侧链而得到7-ADAC，但已证明该侧链对酶促裂解具有顽强的抗性，仅得到令人难于满意的低产量。根据本专利技术可以获得一种有效的生物方法，其中采用高效价新的发酵方法生产青霉素化合物(具有己二酰侧链)，所说的青霉素化合物是为产生青霉素化合物的同一微生物在原位产生的延伸酶所接受的底物，该微生物已进行转化从而表达所说的延伸酶。然后该延伸酶作用于青霉素化合物进行环扩展产生高产量的头孢菌素化合物。由延伸酶的原位作用而产生的己二酰-7-ADCA具有一个3-甲基(-CH3)侧链，而最终产物7-ACA具有一个3-乙酰基氧甲基侧链。为了将3-甲基转变为3-乙酰基氧甲基侧链，根据本专利技术，在原位进一步表达出除活性延伸酶外的另外两位活性酶。它们依次是羟基化酶和乙酰基转移酶，两种都是已进行转化的产生青霉素化合物的微生物的基因表达产物。该羟化酶将己二酰-7-ADCA的3-甲基侧链转化为3-羟甲基，乙酰基转移酶将该3-羟甲基侧链转化为7-ACA的3-乙酰基氧甲基侧链。在本专利技术方法的最后的关键步骤的重要性是利用另一种酶系将青霉素化合物的侧链(现在是一种头孢菌素化合物)以惊人的高产量移走。包括本专利技术在内的这种独特总生物方法的意外的结果是以惊人的高产量产生7-ACA，并且具有重大的经济价值，提供了一种替换目前使用的化学和生化处理方法的手段。本专利技术的新的生物方法提供了一种特定的具有显著效益的制备7-ACA的方法，从经济价值考虑可以用该方法替代目前的化学合成法。本领域内技术人员不断地努力探求这样一种生物方法，但他们屡次遭受失败。例如，EP-A-O422890公开了编码构巢曲霉的活性异青霉素N酰基CoA酰基转移酶的DNA以及其在产生青霉素的真菌中生产有用的头孢菌素中的应用，到目前为止，本领域内技术尚未能完成此项工作。但是上面所描述的方法是通过断裂或替代乙酰基转移酶基因并同时加入编码来自产生头孢菌素的有机体的表异构酶和延伸酶的基因;而且显然实际上并没有取得有效的转化和表达结果，再者，即使成功地进行转化，仍然不能用作本专利技术目的，因为仍然存在怎样移走O-α-氨基己二酰侧链的问题。本领域内技术人员试图从产生青霉素的真菌培养物中生产商品头孢菌素中间产物的方法中获得有效结果的这样一个失败的计划是与本专利技术方法取得的结果完全相反的。本专利技术方法的第一个酶促生物方法步骤是由延伸酶作用的对己二酰-6-APA进行环扩展，该延伸酶是经过转化的非重组产黄青霉菌宿主的延伸酶基因的表达产物。在现有技术中已研究了该延伸酶的用途。例如Cantwell等人在CurrGenet(1990)17∶213-221上已提出了通过对青霉素V进行环扩展，然后酶促水解得到的去乙酸基头孢菌素V而形成7-ADCA的7-ADCA生物方法。该方案是以能够获得来自S.clavuligerus的一种克隆青霉素N延伸酶基因(cefE)为基础的。但是，由于延伸酶对其天然底物青霉素N起作用，而不作用于青霉素V，因而该方案中需要遗传工程步骤以产生能将青霉素V进行环扩展的经过修饰的延伸酶基因。Cantwell等人没有获得所要求的修饰作用，但是，他们仅在用来自Streptomycesclavuligerus的cefE基因转化产黄青霉菌并且获得了低水平地表达DAOCS(延伸酶)酶的工作中取得成功。本领域内技术人员已对该延伸酶包括其活性和遗传序列进行了充分的研究。例如，在Wolfe的U.S.4，510，246和4，536，476中已从包括Streptomycesclavuligerus在内的产生β-内酰胺的原核生物的无细胞提取物中分别分离到了环化酶，表异构酶和环延伸酶，并且提供了稳定的酶试剂。DotzlafU.S.5，082，772(EP-A-0366354)中描述了一种来自S.clavuligerus的离体的纯化的延伸酶，并对其进行定性，包括其末端残其和氨基酸组成，据说其分子量约为34，600道尔顿。但是与其相反，在U.S.4，536，476中发现同样的酶其分子量为29，000道尔顿。本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备７－氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（７－ＡＤＡＣ）的新生物方法，该方法包括：１）将能产生异青霉素Ｎ的产黄青霉菌菌株培养于能供养其生长的培养基中，向所说的培养基中加入己二酸盐原料，该原料包括一种或多种能为所说产黄青霉菌菌株同化和利用并产生己二酰－６－氨基青霉菌烷酸（己二酰－６－ＡＰＡ）的己二酸，或其盐和酯，从而产生所说的己二酰－６－ＡＰＡ；２）由原位表达相应的基因而完成下列酶促变化：ａ）由延伸酶在原位将己二酰－６－ＡＰＡ进行环扩展而形成己二酰－７－氨基去乙酸头孢菌烷酸（己二酰－７－ＡＤＣＡ），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受所说己二酰－６－ＡＰＡ作为底物的活性延伸酰的ＤＮＡ进行转化，在其表达之后，由所说菌株产生的己二酰－６－ＡＰＡ接着在原位进行环扩展而形成己二酰－７－ＡＤＣＡ；ｂ）由羟化酶在原位将己二酰－７－ＡＤＣＡ的３－甲基侧链进行羟基化而产生己二酰－７－氨基脱乙酰基头孢菌烷酸（己二酰－７－ＡＤＡＡ），其中所说的产黄青霉菌菌株已用编码能接受己二酰－７－ＡＤＣＡ作为底物的活性羟基化酶的ＤＮＡ进行转化，在其表达后，也在原位由所说菌株产生的己二酰－７－ＡＳＣＡ进行环扩展而形成己二酰－７－ＡＤＡＣ；并且３）将所说己二酰－７－ＡＤＡＣ与己二酰酰胺酶接触，从而移走己二酰侧链，并形成７－ＡＤＡＣ产物；然后分离所说的产物。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MJ康达，AM施蒂彭，L克罗福德，JA兰波塞克，PC麦阿达，CD里斯，
申请(专利权)人：吉斯特布罗卡迪斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]