用于测定抗体或配体结合和功能的基于细胞的测定制造技术

本发明专利技术涉及用于在同一小管中组合测定抗体或配体结合和功能的新的基于细胞的测定。

Cell based determination of the binding and function of antibodies or ligands

The present invention relates to a new cell based determination of antibody or ligand binding and function in the same tubule.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定抗体或配体结合和功能的基于细胞的测定
本专利技术涉及用于测定抗体或配体结合和功能的新的基于细胞的测定。
技术介绍
化学疗法直到现在仍是最常用的癌症治疗之一。但是，由于化疗剂主动靶向分裂细胞(癌细胞的一个特征)，健康的分裂细胞如血细胞；肠、口腔和毛发中的细胞也受影响，产生很强的副作用。科学家一直致力于改善化疗剂的施用和组合，以最小化那些副作用。此外，基于抗体的治疗在过去15年中演变，现在在恶性血液肿瘤和实体瘤的治疗中是化学疗法方法的有价值的组合或替代。与化学疗法不一样，抗体治疗靶向癌细胞上的特异性抗原，从而允许更定向的治疗，从而减少对健康组织的副作用。在开发基于抗体的治疗剂的过程中，需要多种测定来鉴定最好的候选治疗剂进入临床试验，最终上市。在第一个早期临床前阶段，必须产生抗体，并分析它们的靶标特异性，以及它们对靶标的亲和力和功能性。结合特性可以用多种蛋白质-蛋白质相互作用测定分析，如基于FRET的方法、表面等离振子共振(SPR)、萦光激活细胞分选(FACS)或AlphaScreenTM。通常在设计为尽可能接近生理环境的多种基于细胞的测定中测试功能性，以鉴定最佳候选者来在进入临床试验之前在动物模型中测试。这些功能性测定通常用原代细胞、肿瘤细胞系或设计为在激活特异性途径时表达报道分子的报道细胞进行。在抗体治疗分子开发过程的早期阶段设计允许评估结合和功能性的组合测定具有重要意义。本专利技术的专利技术人开发了将抗体和抗体样构建体(例如配体)的结合和功能性评估组合在同一个小管(vial)中的新测定。此新测定用于例如筛选或表征目的。此新测定是不仅针对结合还针对功能性进行早期筛选的有价值的工具，其将允许在开发候选药物的早期阶段鉴定最佳结合剂。专利技术概述在一个实施方案中，提供用于测定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合和功能性的体外测定，其包括以下步骤：i)提供细胞，该细胞a)在其表面表达靶抗原；b)用能量供体化合物共价或非共价标记；和c)包含靶抗原反应元件控制下的报道基因；ii)加入待测试的抗体或配体；iii)通过测定能量转移来测量与靶抗原的结合，其中能量受体化合物共价或非共价缀合于待测试的抗体或结合一抗的二抗；和iv)通过将报道基因表达水平与靶抗原激活或抑制水平相关来测定抗体或配体的功能性。在一个实施方案中，该能量转移供体和受体化合物是萦光共振能量转移(FRET)能量供体和受体化合物，在步骤iii)中测定的能量转移是萦光共振能量转移(FRET)。在一个实施方案中，该FRET是时间分辨FRET。在一个实施方案中，该FRET能量供体化合物是铽穴合物(cryptate)和/或该FRET能量受体化合物是d2。在一个实施方案中，该能量供体和受体化合物是生物发光能量转移(BRET)能量供体和受体化合物，在步骤iii)中测定的能量转移是生物发光能量转移(BRET)。在一个实施方案中，该能量供体和受体化合物是alphascreen受体和供体小球，在步骤iii)中测定的能量转移是受体小球内从单线态氧至二甲基噻吩衍生物的能量转移。在一个实施方案中，在同一个小管中测量抗体与靶抗原的结合和功能性。在一个实施方案中，用能量供体化合物共价或非共价标记靶抗原。在一个实施方案中，该能量供体化合物与麦胚凝集素(WGA)共价或非共价连接。在一个实施方案中，该报道基因选自编码萦光蛋白质的基因或编码可以检测其催化活性的酶的基因。在一个实施方案中，该报道基因编码绿色萦光蛋白(GFP)或萦光素酶。在一个实施方案中，该靶抗原是细胞表面受体。在一个实施方案中，步骤iii)和iv)顺次进行或同时进行。在一个实施方案中，该靶抗原和反应元件是NF-κB途径的部分。在一个实施方案中，该反应元件包含具有DNA序列SEQIDNO:1、2、3、4或5的至少一个DNA重复。在一个实施方案中，该反应元件包含DNA序列SEQIDNO6、7、8或9。在一个实施方案中，该测定包括用含有靶抗原反应元件控制下的编码报道基因的DNA序列的表达载体转染细胞的预备步骤。附图简述图1.SNAP-受体X转染和供体萦光染料铽标记后细胞的转染效率测定及活力测量。在615nm波长测量每孔10000个细胞的铽信号。比较了转染试剂Lipofectamine2000、LipofectamineLTX和XtremeGeneHP。图2.SNAP-受体X转染和供体萦光染料铽标记后HEKNFκB-Luc-GFP和HeLaNFκB-Luc细胞的LipofectamineLTX转染效率测定及活力测量。在615nm波长测量每孔10000个细胞的铽信号。图3.抗体-I和抗体-II与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP和HeLaNFκB-Luc细胞的间接结合测定。抗体按2倍稀释系列从25nM稀释至0.05nM。使用浓度为150nM的d2标记二抗。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图4.抗体-I与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞结合的间接结合测定。抗体-I按2倍稀释系列从12.5nM稀释至0.025nM。使用浓度为150nM或75nM的d2标记二抗。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图5.抗体-I、抗体-III和抗体-IV与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的间接结合测定。所有抗体按2倍稀释系列从20nM稀释至0.04nM。使用浓度为75nM的d2标记二抗。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图6.抗体-III与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的间接结合测定。抗体以2倍稀释系列按从20nM至0.04nM的浓度稀释。使用浓度为75nM的d2标记二抗。比较室温孵育和37℃孵育。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图7.抗体-III与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞结合的间接结合测定。抗体以2倍稀释系列按从20nM至0.04nM的浓度稀释。使用浓度为75nM的d2标记二抗。比较用于稀释的不同缓冲液和培养基。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图8.抗体-III与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞结合的间接结合测定。在解冻细胞后直接及在随后3天的每一天进行实验。抗体以2倍稀释系列从20nM稀释至0.04nM。使用浓度为75nM的d2标记二抗。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图9.标记的表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的铽信号和活力的测定。解冻后直接及在随后3天的每一天测量铽信号。每天接种每孔10000个细胞，并在615nm波长测量。图10.孵育6小时后抗体-I和TNFα与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的萦光素酶1000测定系统。TNFα稀释系列(2倍)从25至0.8ng/ml，抗体-I稀释系列(4倍)从30至0.03nM。用抗体-I和二抗单独作为对照。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图11.TNF-a激活孵育48小时后ONE-GloTM萦光素酶测定系统与萦光素酶1000测定系统比较。通过TNFα(50ng/ml)激活稳定转染的HEKNFκ本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合和功能性的体外测定，包括以下步骤：i)提供细胞，该细胞a)在其表面表达靶抗原；b)用能量供体化合物共价或非共价标记；和c)包含靶抗原反应元件控制下的报道基因；ii)加入待测试的抗体或配体；iii)通过测定能量转移来测定与靶抗原的结合，其中能量受体化合物共价或非共价缀合于待测试的抗体或结合一抗的二抗；和iv)通过将报道基因表达水平与靶抗原激活或抑制水平相关，来测定抗体或配体的功能性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.25 EP 15173929.91.用于测定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合和功能性的体外测定，包括以下步骤：i)提供细胞，该细胞a)在其表面表达靶抗原；b)用能量供体化合物共价或非共价标记；和c)包含靶抗原反应元件控制下的报道基因；ii)加入待测试的抗体或配体；iii)通过测定能量转移来测定与靶抗原的结合，其中能量受体化合物共价或非共价缀合于待测试的抗体或结合一抗的二抗；和iv)通过将报道基因表达水平与靶抗原激活或抑制水平相关，来测定抗体或配体的功能性。2.权利要求1的测定，其中能量供体和受体化合物是萦光共振能量转移(FRET)能量供体和受体化合物，在步骤iii)中测定的能量转移是萦光共振能量转移(FRET)。3.权利要求2的测定，其中FRET是时间分辨FRET。4.权利要求3的测定，其中FRET能量供体化合物是铽穴合物和/或FRET能量受体化合物是d2。5.权利要求1的测定，其中能量供体和受体化合物是生物发光能量转移(BRET)能量供体和受体化合物，在步骤iii)中测定的能量转移是生物发光能量转移(BRET)。6.权利要求1的测定，其中能量供体和受体化合物是AlphaScreen受体和供体小球，在步骤i...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·阿尔布雷赫特，M·阿曼，C·克劳斯，S·格劳理查兹，J·杰隆卡，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH