一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响制造技术

一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×106个细胞，分别加入4支试管中；40g・L‑１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L‑１ Tween80中30min,1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL‑１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1：100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１ Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS 400μL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。

The effect of pressure overload on Bax and Bcl of ventricular myocytes in rats

【技术实现步骤摘要】
一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响
本专利技术涉及一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，具体地说是以一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响。
技术介绍
目前公知的压力超负荷时存在着心肌细胞凋亡。B细胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成员Bax蛋白在细胞凋亡的调控过程中起着重要的作用。
技术实现思路
诊断标准：材料与方法；动物及分组，普通级SD大鼠24只，雌性，体重180～220g，购自广州中医药大学实验动物中心，随机分为8组，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d8个时间点，每组各3只。主要器材与试剂，牙用不锈钢丝(上海牙科医械厂，批号：K41701)；分析天平(LIBRORAEU210，Shimadzu)；抽滤器(NALGENE,NalgeCompany)；离心机(LD52A，北京医用离心机厂)；光学显微镜(BH2，Olympus)；流式细胞仪(EPICSALTRA，BeckmanCoulter)。Ficoll(Sigma,华美生物工程公司分装，批号：38H0588)；多聚甲醛(广州化学试剂厂，批号：99010136)；小鼠抗大鼠BaxAb4(6A7)(Neomarkers，批号：714P010)；小鼠抗大鼠Bcl2αAb4(10C4)(Neomarkers，批号：598P111)；藻红蛋白(RPE)标记的羊抗小鼠F(ab′)2IgG(Serotec，批号：280901)；封闭用羊血清(北京中山生物技术有限公司，批号：ZLI9021)；RPE标记的羊F(ab′)2IgG(SouthernBiotechnologyAssociateInc，批号：J366W490B)。心衰模型的复制，以腹主动脉缩窄法复制大鼠左心室压力超负荷模型。给大鼠腹腔注射100g・L-１水合氯醛，剂量35mL・kg-１，麻醉后，暴露腹主动脉，并于双侧肾动脉上方钝性分离腹主动脉，用4号缝合线将腹主动脉和与腹主动脉平行放置的外径约06～09mm的牙用不锈钢丝一并结扎，然后轻轻取出不锈钢丝，使腹主动脉截面积缩窄至原来的25%～30%左右，造成腹主动脉狭窄，关腹。假手术组，钝性分离腹主动脉后，缝合线仅绕于腹主动脉上，并不缩窄，且在术后3d内给予肌肉注射青霉素(18000U・kg-１），以预防感染。取材；大鼠称体重(mbody)后，麻醉，开胸，迅速取出心脏，分别称取整个心脏质量(mheart)及左心室的质量(mLV)，将左心室剪成两块，用针将心肌穿孔；置于含600mL・L－１甘油的DMEM(DulbeccosModifiedEagleMedium)的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。心肌细胞的分离与纯化；从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻；用DMEM清洗心脏；将左心室剪碎成1mm３的小块，于KrebsHenseleit液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复1次；将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800r/min离心5min，01mol・L-１磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，800r/min离心5min；将沉淀轻轻加入40g・L-１的Ficoll上，400r/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。Bax、Bcl2蛋白的检测，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×１０６个细胞，分别加入4支试管中；40g・L-１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，弃上清，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L-１Tween80中30min,1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL-１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1∶100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；每试管中加入5μLRPE标记的羊抗小鼠抗体或10μLRPE标记的羊抗小鼠的同型对照，室温下孵育30min，加入5mL・L－１Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS400μL，待上机检测。使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。结果；造模结果，24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d内死于急性左心衰，解剖发现双肺明显瘀血，部分还伴有胸腔积液，其死亡与急性压力超负荷有关。大鼠在造模后心脏质量(mheart)、左心室的质量(mLV)逐渐增加，第30～40天之间，其增幅有所减少；心脏、左心室质量与体重之比，即心脏质量指数(CMI，IＣＭ＝mheart/mbody)、左心室质量指数(LVMI，IＬＶ＝mLV/mbody)，亦随时间的延长而增加，约于第30天达到最高值，可能与后负荷增加引起的代偿性肥厚有关，到第40天时，二者的比值已开始降低。在腹主动脉缩窄后第1天，大鼠左心室心肌细胞Bax蛋白的表达率较高(6375%)，第4天已下降，在以后的时间中，其表达率变化不大，波动于50%～60%之间；Bcl2蛋白的表达率于第1天时较低(3145%)，随后上升，第7天升至最高值(7175%)，尔后开始下降，第30天时其表达率最低(228%)；RBax/RBcl2于第1天时较高，第4天时已下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值(24)，到第40天时又下降，两者荧光强。专利技术目的：心脏的压力超负荷情况下，心脏首先代偿性地向心性肥厚，随后，心肌细胞增长，心室腔的扩大，心室几何形态的变化，心肌细胞外间质发生胶原沉积和纤维化，即心室重塑，最终因失代偿而发生心衰，在此过程中心功能的进行性恶化可能与心肌细胞凋亡有关。细胞凋亡受到程序控制，Bcl2和Bax是Bcl2家族中的重要成员，Bcl2蛋白抑制细胞凋亡，而Bax蛋白则促进细胞凋亡。Bcl2、Bax蛋白可形成同源二聚体，也可相互间形成异源二聚体，Bcl2与Bax的比例(RBcl2/RBax)决定细胞是否发生凋亡，尽管细胞内这一比例是固定的，但外界刺激可以改变抑制凋亡的Bcl2Bax与促进凋亡的BaxBax的量发生改变。随着Bcl2表达的增多，BaxBax分开，形成Bcl2Bax异源二聚体，若细胞中50%的Bax与Bcl2形成异源二聚体，若80%的Bax以同源二聚体的形式存在，则细胞容易发生凋亡。对压力超负荷大鼠心室肌细胞Bax、Bcl2蛋白的表达规律进行了研究。技术方案：大鼠称体重(mbody)后，麻醉，开胸，迅速取出心脏，分别称取整个心脏质量(mheart)及左心室的质量(mLV)，将左心室剪成两块，用针将心肌穿孔；置于含600mL・L－１甘油的DMEM(DulbeccosModifiedEagleMedium)的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。心肌细胞的分离与纯化；从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻；用DMEM清洗心脏；将左心室剪碎成1mm３的小块，于KrebsHenseleit液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复1次；将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800r/min离心5min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×106个细胞，分别加入4支试管中；40g・L‑１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L‑１ Tween80中30min,1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL‑１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1：100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１ Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS 400μL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。

【技术特征摘要】
1.一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×106个细胞，分别加入4支试管中；40g・L-１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L-１Tween80中30min,1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL-１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1：100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１Tween80孵育5～10min，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS400μL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：将细胞重悬于10mL・L-１Tween80中30min,...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨恩茂，
申请(专利权)人：杨恩茂，
类型：发明
国别省市：甘肃,62