一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法技术

本发明专利技术公开了一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，将宫颈鳞癌组织制成组织芯片，进行免疫组化实验、病理医生免疫评分，根据免疫评分进行分组，按照Sufu蛋白的着染情况将患者分为Sufu蛋白阳性表达组和阴性表达组，运用统计学方法分析两组病人的临床特征。临床数据统计结果显示Sufu蛋白阳性表达组的患者更容易出现脉管癌栓(p＝0.046)和间质浸润深度≥1/2(p＝0.041)，且Sufu蛋白的高表达与患者临床分期(p＝0.008)增加明显相关。结果表明Sufu蛋白阳性表达的情况可以直接确定宫颈鳞癌恶性程度和临床特征，此评价方法简单，为评价宫颈鳞癌提供了新的方法和标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法
本专利技术涉及一种宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，具体涉及一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法。属于宫颈鳞癌预后

技术介绍
宫颈癌是目前最常见的妇科肿瘤之一，在全世界范围内，每年新增53万病例，并且有27.5万人死亡。在发展中国家，有效的筛查、评价和治疗手段能够极大的降低发病率和死亡率。从组织学角度而言，正常宫颈上皮进展成为宫颈鳞状细胞癌(CSCC)是需要经历一系列的癌前病变，包括由低级别的鳞状上皮内病变(LSILs)演变为高级别的鳞状上皮内病变(HSILs)。因此，对于诊治宫颈鳞癌最主要的一个问题就是区别LSILs和HSILs。目前，利用组织学手段来评价SIL的金标准已经被发现，但是，在不同的观察者之间却具有很大的差异。虽然一些分子标记物，如p16INK4a和Ki-67可以提供支持组织学评价CSCC的客观标准，但是它们的作用仍然有限。因此，评价CSCC亟需一些重要的临床特异性标志物。此外，不同评价结果对于临床预后也有极大的帮助；给与个性化治疗和提高诊疗手段的转化医学，针对不同病人病情的发展而寻找特异性的分子标志物，为判断宫颈鳞癌患者的预后变得极为重要。尽管一些潜在分子标志物已经能够预测宫颈鳞癌的生存率，但是目前还没有得到非常满意的结果。因此，寻找新的、特异性分子标志物作为宫颈鳞癌的评价标准和治疗靶点显得尤为迫切。Hedgehog(Hh)信号通路调控着一系列发育的过程和肿瘤的产生，Hh蛋白是12次跨膜蛋白受体Ptch1蛋白的配基，Ptch1能反向调节7次跨膜蛋白Smo。Hh配基与Ptch结合，导致Smo的激活。这将导致Smo转运至原纤毛中，Hh通路也得以正常转运。Smo的下游是Gli蛋白家族，它们属于锌指转录因子家族，在哺乳动物中具有三个同源蛋白，Gi1、Gli2和Gli3。Suppressoroffused(Sufu)作为Gli蛋白的分子伴侣，能够与所有的Gli蛋白结合而形成复合物。最初人们认为Sufu基因外显子缺失突变导致它失去了铆钉Gli转录因子在细胞浆中的能力，导致Gli进入细胞核、促进下游基因转录而使得Shh通路激活，并最终导致肿瘤的产生。然而，目前对于Sufu蛋白在Shh通路的作用机制却众说纷纭，它既能通过两个位点与Gli蛋白结合、将Gli阻碍在细胞浆而不能进入细胞核内，也能通过招募转录抑制复合物而发挥其降低Gli转录活性的功能。因此Sufu蛋白一直被认为是Shh信号通路中的抑癌基因。但是，也有证据表明Sufu蛋白能够正向调节Shh信号通路，但是其中详实的机理并不清楚。近期有文章阐明Sufu蛋白可以作为分子伴侣同Gli进入细胞核内、发挥稳定Gli1蛋白的活性进而促进Shh信号通路的最大化激活，这一功能与信号通路另一成员Kif7的正反调节能力极为相似。目前的研究报道证实Hh信号通路的过度活化与宫颈鳞癌的产生密切相关，因此，Sufu蛋白作为Hh通路最大化激活的促进因子在宫颈鳞癌癌的发生起着至关重要的作用，并可能成为新的宫颈鳞癌的诊断和治疗的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，利用宫颈鳞癌组织制成组织芯片，进行免疫组化实验和病理医生免疫评分，按照组织内Sufu蛋白的着染情况对宫颈鳞癌恶性程度进行评价，包括以下步骤：1)组织芯片制作，包括：(1)制作组织芯片石蜡块切片将获取的组织进行透化、石蜡包埋，得到组织石蜡块，从组织石蜡块中采集圆柱形小组织，将其整齐排放到另一个空白蜡块中制成组织芯片蜡块，对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片；(2)将制作好的组织芯片进行脱石蜡、水化处理；(3)对步骤(2)中经脱石蜡、水化处理后的组织芯片进行免疫组化染色；2)结果评价依照各组织芯片的染色强度及染色细胞数进行综合分析评分，评价宫颈鳞癌的恶性程度。作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法为：①获取的组织在质量-体积浓度为4％的多聚甲醛中，4℃固定24小时后取出，用PBS洗3次，每次2～3分钟，将PBS倒掉，然后按乙醇浓度由低到高进行梯度脱水，最后利用二甲苯透化组织；②将已透明处理的组织放入溶化的65℃石蜡中浸泡3小时进行包埋；③利用芯片打孔机将蜡块中的癌灶打下，放于新的蜡块中，制作成组织芯片蜡块；④将组织芯片蜡块固定在石蜡切片机上，进行切片，切片放入40℃蒸馏水表面进行摊片；⑤用APES进行防脱片处理的载玻片捞片，放入55℃烤箱中过夜，得到组织芯片。作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法为：①二甲苯浸泡10分钟，更换新的二甲苯后，再浸泡10分钟，共重复三次；②纯乙醇浸泡1分钟；③体积浓度为95％乙醇浸泡1分钟；④体积浓度为85％乙醇浸泡1分钟；⑤体积浓度为75％乙醇浸泡1分钟；⑥体积浓度为50％乙醇浸泡1分钟；⑦蒸馏水洗两次，每次2分钟。作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法为：①利用pH＝6.0的0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液进行抗原修复；②用TBS稀释的体积浓度为5％的正常山羊血清封闭组织1小时；③采用TBS冲洗3次，每次2分钟；④用ddH2O配置的体积浓度为3％H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶；⑤用TBS冲洗3次，每次2分钟；⑥加入Sufu蛋白的一抗，4℃孵育过夜，其中一抗使用抗体稀释液按照1:100的体积比配制；⑦次日，用TBS冲洗3次，每次2分钟；⑧室温孵育二抗200ul，二抗为兔超敏两步法免疫组化检测试剂盒内试剂1和2各200ul；⑨采用DAB显色，经苏木素染液复染核、酒精梯度脱水、二甲苯透明后用中性树脂封片，使用光学显微镜观察。作为优选的技术方案之一，步骤2)的评分标准为：(1)染色强度分为：a.未着色－0分；b.淡棕黄色－1分；c.棕黄色－2分；d.棕褐色－3分；(2)阳性细胞百分数分为：a.阳性数≤5％－0分；b.5％＜阳性数≤25％－1分；c.25％＜阳性数≤50％－2分；d.50％＜阳性数≤75％－3分；e.阳性数＞75％－4分；将上述两项结果相乘，0～2分为阴性(-)；3～4分为弱阳性(+)；5～6分为阳性(++)；7～8分为强阳性(+++)，将阴性(-)和弱阳性(+)作为低表达，属于阴性表达，阳性(++)和强阳性(+++)作为高表达；通过SPSS11.0软件对Sufu蛋白染色结果结合临床数据进行统计分析。作为优选的技术方案之一，步骤(2)①的具体方法为：将足够覆盖所有切片的0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液在高压锅中加热至沸腾，将组织芯片放入抗原修复液中，盖上高压锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时5分钟，关闭高压锅热源，待高压锅压力降至零时，打开锅盖，修复液自然降至室温后，TBS洗3次，每次2分钟。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的评价方法，是将宫颈鳞癌组织制成组织芯片，进行免疫组化实验、病理医生免疫评分，根据免疫评分进行分组，按照Sufu蛋白的着染情况将患者分为Sufu蛋白阳性表达组和阴性表达组，运用统计学方法分析两组病人的临床特征。临床数据统计结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，其特征在于，利用宫颈鳞癌组织制成组织芯片，进行免疫组化实验和病理医生免疫评分，按照组织内Sufu蛋白的着染情况对宫颈鳞癌恶性程度进行评价，包括以下步骤：1)组织芯片制作，包括：(1)制作组织芯片石蜡块切片将获取的组织进行透化、石蜡包埋，得到组织石蜡块，从组织石蜡块中采集圆柱形小组织，将其整齐排放到另一个空白蜡块中制成组织芯片蜡块，对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片；(2)将制作好的组织芯片进行脱石蜡、水化处理；(3)对步骤(2)中经脱石蜡、水化处理后的组织芯片进行免疫组化染色；2)结果评价依照各组织芯片的染色强度及染色细胞数进行综合分析评分，评价宫颈鳞癌的恶性程度。

【技术特征摘要】
1.一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，其特征在于，利用宫颈鳞癌组织制成组织芯片，进行免疫组化实验和病理医生免疫评分，按照组织内Sufu蛋白的着染情况对宫颈鳞癌恶性程度进行评价，包括以下步骤：1)组织芯片制作，包括：(1)制作组织芯片石蜡块切片将获取的组织进行透化、石蜡包埋，得到组织石蜡块，从组织石蜡块中采集圆柱形小组织，将其整齐排放到另一个空白蜡块中制成组织芯片蜡块，对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片；(2)将制作好的组织芯片进行脱石蜡、水化处理；(3)对步骤(2)中经脱石蜡、水化处理后的组织芯片进行免疫组化染色；2)结果评价依照各组织芯片的染色强度及染色细胞数进行综合分析评分，评价宫颈鳞癌的恶性程度。2.根据权利要求1所述的一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：①获取的组织在质量-体积浓度为4％的多聚甲醛中，4℃固定24小时后取出，用PBS洗3次，每次2～3分钟，将PBS倒掉，然后按乙醇浓度由低到高进行梯度脱水，最后利用二甲苯透化组织；②将已透明处理的组织放入溶化的65℃石蜡中浸泡3小时进行包埋；③利用芯片打孔机将蜡块中的癌灶打下，放于新的蜡块中，制作成组织芯片蜡块；④将组织芯片蜡块固定在石蜡切片机上，进行切片，切片放入40℃蒸馏水表面进行摊片；⑤用APES进行防脱片处理的载玻片捞片，放入55℃烤箱中过夜，得到组织芯片。3.根据权利要求1所述的一种通过Sufu蛋白阳性表达情况对宫颈鳞癌恶性程度的评价方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：①二甲苯浸泡10分钟，更换新的二甲苯后，再浸泡10分钟，共重复三次；②纯乙醇浸泡1分钟；③体积浓度为95％乙醇浸泡1分钟；④体积浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张子宇，邹阳，杨必成，刘发英，罗勇，
申请(专利权)人：江西省妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江西,36