本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法。该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ40蛋白的定量检测。本发明专利技术建立的IP‑MALDI‑TOF方法在一定浓度范围内可以用来测量小鼠脑组织匀浆上清中的Aβ40蛋白含量，该方法操作简单，稳定性和精密度良好，为Aβ蛋白的测量提供了新的思路。
A method for quantitative detection of A beta 40 protein in brain tissue
The invention belongs to the field of biological detection, in particular to a method for quantitative detection of A beta 40 protein in brain tissue. The method by combining immune precipitation and matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, quantitative detection of brain tissue A protein beta 40. IP MALDI TOF the method of the invention can be used to measure the brain tissue homogenates of mice in the A beta 40 protein content in a certain range of concentration, the method has the advantages of simple operation, good stability and precision, provides a new method for measuring A beta protein.
【技术实现步骤摘要】
一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法
本专利技术属于生物检测领域，更具体地，涉及一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法。
技术介绍
Aβ淀粉样蛋白(Aβ)由第21号染色体编码，是淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶作用后的底物，是阿尔茨海默病脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解启动和贯穿了AD的整个病理过程。Aβ42是由42个氨基酸组成的蛋白质片断(其氨基酸序列为DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，如SEQIDNO：1所示)，若在其缬氨酸711和异亮氨酸712之间酶切割则形成Aβ40(其序列为DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，如SEQIDNO：2所示)。Aβ40是由40个氨基酸组成的蛋白片断，正常老年人和AD患者脑内均存在，并且AD患者脑中含量多于正常患者。Aβ蛋白在脑中含量很少、容易聚集并且脑中基体复杂，这些都为Aβ在脑中的绝对定量造成了困难。现在常用的定量方法是ELISA酶联免疫试剂盒法，酶免疫试验还是有其局限性的，不但所检测的生物学体液样本如组织匀浆液中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，影响结果的因素也很多，尤其是进行手工ELISA测定时。因此，亟待一种能准确绝对定量脑组织中的Aβ40蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能准确绝对定量脑组织中Aβ40蛋白的方法。免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用磁珠上的抗体与之进行特异性结合的特性，来进行研究。这项技术可用来将含有上千种不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质。目前常用的IP后目标蛋白鉴定的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、WesternBlot、质谱鉴定等。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都十分简单和高效。本专利技术建立了一种联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的方法，命名为IP-MALDI-TOF技术，检测脑组织中Aβ40蛋白，并在进MALDI-TOF之前就加入一种内标物，以此来准确绝对定量脑组织中的Aβ40蛋白。具体地，本专利技术提供一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法，该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ40蛋白的定量检测。更具体地，该方法包括以下步骤：(1)将含有Aβ40蛋白的待测样品与偶联有Aβ40蛋白抗体的磁珠混合，通过免疫沉淀把目标Aβ40蛋白富集到磁珠上，形成磁珠-抗体-蛋白复合物；(2)用洗脱液洗脱，将Aβ40蛋白从磁珠-抗体-蛋白的复合物中分离出来，进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测。免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从蛋白样品前处理、抗体-磁珠的孵育、抗体-磁珠复合物洗脱到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到实验目的。根据本专利技术，优选地，所述Aβ40蛋白抗体包括Biolegend公司的三种抗Aβ40蛋白抗体：M2.3、4G8、11A50-B10。利用这三种抗体同时连接到磁珠上按上述方法富集Aβ40标准蛋白，通过MALDI-TOF检测，回收率达到48.7％。根据本专利技术，所述洗脱液为酸性洗脱液，包括但不限于盐酸。所述洗脱液的pH值优选为1.0-3.0。优选地，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定中，以α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。本专利技术利用基于内标法的MALDI-TOFMS的定量分析方法。由于任何影响目标物和内标物离子化效率及信号强度的因素均影响定量分析结果。因此，在实际样品的定量分析过程中，内标的选择很重要。本专利技术的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测为内标检测法，使用与Aβ40相差2个氨基酸的Aβ42蛋白作为内标，后者不会影响前者的离子化过程，且两者有类似的离子化效率，适合作为内标。经实验验证，Aβ40与内标Aβ42具有线性关系，线性范围为120ng/ml-600ng/ml。可以通过添加一定浓度的内标与待检测样品混合进样，得出两种物质信号强度的比值，根据已经绘制好的标准曲线就可以实现对待检测物质的定量。本专利技术方法的检出限为2.94μg/L，定量限为9.80μg/L。本专利技术建立的IP-MALDI-TOF方法在一定浓度范围内可以用来测量小鼠脑组织匀浆上清中的Aβ40蛋白含量，该方法操作简单，稳定性和精密度良好，为Aβ蛋白的测量提供了新的思路。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述。图1示出了加入内标后Aβ40蛋白的MALDI-TOF线性标准曲线。图2示出了不同抗体对IP作用的影响。图3示出了Biolegend三种抗体识别位点。图4示出了不同洗脱方式的比较结果。图5示出了IP-MALDIMS的线性标准曲线。图6示出了Bradford法测总蛋白标准曲线。图7示出了ELISA测Aβ40标准蛋白的标准曲线。图8示出了IP-MALDI-TOFMS与ELISA定量鼠脑基体中Aβ40蛋白浓度的比较结果。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。虽然以下描述了本专利技术的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施方式所限制。以下涉及Aβ40标准蛋白的实验中，为了防止Aβ40标准蛋白的聚集，需要用六氟异丙醇(HFIP)进行前处理，具体操作如下：(1)将Aβ40以1mg/ml浓度溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP，Sigma)中，并分装于EP管(100μg/管)中。(2)放入通风柜中，HFIP蒸发，将得到的透明肽膜在真空下干燥过夜，然后放在-20℃直至使用。(3)若为得到Aβ40的低聚物，将干燥的多肽重新悬浮于DMEM或PBS中至终浓度为100μM，然后在4℃下孵育24小时。使用前可通过Westernblot检测Aβ40的寡聚体形式。实施例1、建立IP-MALID-TOF绝对定量Aβ40蛋白的方法1.1、基于MALDI-TOFMS的定量分析方法(1)基质准备：根据所测多肽分子量大小范围确定最终选择α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质，用的30％乙腈的超纯水溶液(含0.1％的TFA)配制成饱和的基质溶液，基质溶液现配现用。(2)仪器的校正：质谱分析前仪器的质量数釆用BRUKER公司的蛋白标准品利用外标法进行校正。(3)质谱仪参数设定：加速电压：20kV；激光频率：2000HZ；质量扫描范围：3000-10000Da；离子延时提取时间：250ns；激光强度：60％；线性模式。点样：分别取2μl样品点样于靶盘中，等自然挥干后，分别点上1μl基质，完全挥干后放入MALDI-TOFMS中，进行测定。(4)选择合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法，其特征在于，该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ40蛋白的定量检测。
【技术特征摘要】
1.一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法，其特征在于，该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ40蛋白的定量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将含有Aβ40蛋白的待测样品与偶联有Aβ40蛋白抗体的磁珠混合，通过免疫沉淀把目标Aβ40蛋白富集到磁珠上，形成磁珠-抗体-蛋白复合物；(2)用洗脱液洗脱，将Aβ40蛋白从磁珠-抗体-蛋白的复合物中分离出来，进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测。3.根据权利要求1或2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李娇，冯流星，罗施中，韩亚琛，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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