一种含亚麻酸生物制剂的制备方法技术

一种含γ－亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于：采用保藏号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０４２２的刺孢小克银汉霉为菌种；发酵罐培养基为以重量计：蔗糖２－４％、磷酸氢二铵０．０１－０．０２５％、硫酸镁０．０１－０．０３％、氯化钾０．０１－０．０３％、硫酸锌０．００００５－０．０００１％、柠檬酸０．０５－０．１％；培养温度为２８－３０℃，风量１∶０．０５－０．３Ｖ／Ｖ，搅拌速度１８０－２５０ｒＰｍ，罐压０．０４－０．０６ＭＰａ，培养时间１８－２４小时。本发明专利技术生产成本低廉，产率高，并且产品品质好。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工程领域，特别提供了一种高含量γ-亚麻酸生物制剂的大规模生产方法制备方法。γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid GLA)是人体必需脂肪酸，不能由人体合成而只能从食物中获得，它是合成前列腺类物质的前体，对人体的生理功能有重要的调节作用。人体由于缺乏γ-亚麻酸可导致机体代谢紊乱而引起多种疾病，如高血压、糖尿病、癌症、病毒感染、以及皮肤老化等。因此，对γ-亚麻酸生理作用的研究以及开发自然资源的研究受到了广泛的重视。由于自然资源的限制，γ-亚麻酸的生产已从植物转向微生物，微生物具有不受自然条件限制，产品质量稳定，成本低廉等特点。如中国专利ZL91106190.8和已经公开的中国专利申请95111964.8，提供了一种用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata生物发酵制备的以γ-亚麻酸为主要成分的生物制剂及生物制剂的制备方法，该生物制剂不仅含有γ-亚麻酸而且还含有微生物多糖、SOD酶、氨基酸、维生素等多种营养成分和生理活性物质，对改善血液粘稠度具有明显作用。但是，在所提供的制备方法中，特别是在发酵培养的过程中，主要以的蔗糖为碳源、尿素为氮源，价格昂贵；不仅如此，由于尿素容易挥发，在灭菌过程中温度、时间较难掌握，使培养基中含氮量及PH不稳定，必须采用灭菌后重新调PH方法或者尿素分消法，给生产带来许多不便，同时也直接影响到菌体的产量；最后，按照专利中提到的菌种、培养基、培养条件进行简单的放大生产，不能生产出所要求的产品，如专利申请95111964.8的实施例中最大作到500ml发酵罐，可以进一步放大到一吨的发酵罐，五吨的发酵罐就不能生产出合格产品了。本专利技术的目的在于提供一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其生产成本低廉，产率高，并且产品品质好。本专利技术提供了一种含γ-亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于(1)、菌种采用刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422；(2)、制备过程是——菌种培养将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；——种液培养将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计蔗糖2-4％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为28-30℃，风量1∶0.05-0.3V/V，搅拌速度180-250rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间18-24小时；——发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计糖蜜8-12％、豆饼粉0.8-1.5％、磷酸氢二铵0.01-0.025％、硫酸镁0.01-0.03％、氯化钾0.01-0.03％、硫酸锌0.00005-0.0001％、柠檬酸0.05-0.1％；培养温度为25-28℃，风量1∶0.05-0.5V/V，搅拌速度150-180rPm，罐压0.04-0.06Mpa，培养时间80-96小时；——菌体收集、水洗、干燥。本专利技术所使用的刺孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.0422)，是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的，保藏号为3.154的刺孢小克银汉霉，经物理化学方法进行复合诱变，在高浓度碳源培养基上筛选出有明显形态变化的菌落，再经摇瓶复筛获得各项生产指标最佳的菌株，其生物量较原始菌株提高25-30％，脂肪提高10-15％，γ-亚麻酸提高10-15％。诱变的具体方法为将幼龄的菌丝制得原生质体，经紫外线处理15-30秒，再将所获得的菌丝用硫酸二乙酯处理30-60分钟，将处理后的菌悬液在高浓度碳源的培养基上培养，挑菌落形态有明显差异的菌株经摇瓶复筛获得，其复合诱变所获得的变异株与原始菌株相比，具有生长速度快，孢子量多，菌丝粗壮等特点。在PDA培养基上28℃培养，2天菌落直径为2-3厘米，菌丝为灰白色，有部分分生孢子形成。3-4天菌落直径为4-7厘米，分生孢子大量形成，菌落为珠母灰色。显微镜下观察，菌丝粗壮多分枝，直径为15-25μm，分生孢子梗直立，分生孢子为球形或椭圆形，上有长刺。孢子直径为8.75-12.5μm，分生孢子聚伞状，梅花状或不规则状。本专利技术中使用的碳源主要为蔗糖生产中的残渣糖蜜，不仅价格是蔗糖的1/6，并且其中含有多种维生素及生长因子，可免去维生素B1的添加，使原料成本大幅度下降。本专利技术中使用的氮源主要为豆饼粉，不仅价格低廉，同时含氮量稳定，缓冲性强，生产操作易掌握，产量稳定。本专利技术中添加微量的锌可明显增加菌体内不饱和脂肪酸的不饱和度，增加产品的有效组分含量。本专利技术生物制剂可应用于心脑血管疾病的预防和治疗，也可用于保健食品和饲料添加剂。总之，本专利技术中利用工农业生产中的废弃物糖蜜和豆饼粉作原料，可以降低原料成本4/5-4/6，并采用高产诱变菌株，及适合于该菌株生理代谢特点的工艺，缩短发酵时间24-48小时，使能源消耗降低1/5-1/4，在生产操作上简便易行，并且产品各项生产指标稳定。下面通过实施例详述本专利技术。实施例15吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度250rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.1V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.044Mpa，培养时间96小时。(5)将菌体收集、水洗、干燥。得干菌体110kg，脂肪含量38％，γ-亚麻酸含量12.2％。实施例25吨发酵罐生产制取菌体(1)将生产菌种接种于PDA斜面培养基扩大培养28℃2-3天。(2)将斜面菌种接种于PDA克氏瓶中扩大培养28℃2-3天。(3)将克氏瓶中菌种数个制得孢子悬浮液接种于种子培养基中，种子罐为500立升，投料350立升，培养基为蔗糖14kg、磷酸氢二铵88g、硫酸镁105g、氯化钾91g、柠檬酸350g；培养温度为28℃，风量1∶0.08V/V，搅拌速度150rPm，罐压0.04Mpa，培养时间24小时。(4)将发育良好的种子液转接至发酵罐中，发酵罐体积5吨，投料3.5吨，接种量10％，培养基为糖蜜350kg、豆饼粉30kg、磷酸氢二铵0.88kg、硫酸镁1.05kg、氯化钾0.91kg、硫酸锌3.5g、柠檬酸3.5kg；培养温度为28℃，风量1∶0.25V/V，搅拌速度180rPm，罐压0.04Mpa，培养时间96小时。(5)将菌体收集、水洗、干燥。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含γ－亚麻酸生物制剂的制备方法，其特征在于：（１）、菌种采用刺孢小克银汉霉Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０４２２；（２）、制备过程是 ：－菌种培养：将斜面菌种进行活化，接至茄形瓶中进行扩大培养；－种液培养：将制成的孢子悬浮液接于种子罐中进行培养；培养基为以重量计：蔗糖 ２－４％、磷酸氢二铵 ０．０１－０．０２５％、硫酸镁 ０．０１－０．０３％、氯化钾 ０．０１－０ ．０３％、硫酸锌 ０．００００５－０．０００１％、柠檬酸 ０．０５－０．１％；培养温度为２８－３０℃，风量１：０．０５－０．３Ｖ／Ｖ，搅拌速度１８０－２５０ｒＰｍ，罐压０．０４－０．０６Ｍｐａ，培养时间１８－２４小时；－发酵罐培养：将生 长良好的种子液接入发酵罐中培养；培养基为以重量计：糖蜜 ８－１２％、豆饼粉 ０．８－１．５％、磷酸氢二铵 ０．０１－０．０２５％、硫酸镁 ０．０１－０．０３％、氯化钾 ０．０１－０．０３％、硫酸锌 ０．００００５－０．０００１％、柠檬酸０．０５－０．１％；培养温度为２５－２８℃，风量１：０．０５－０．５Ｖ／Ｖ，搅拌速度１５０－１８０ｒＰｍ，罐压０．０４－０．０６Ｍｐａ，培养时间８０－９６小时；－菌体收集、水洗、干燥。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宏，花红英，
申请(专利权)人：沈阳大有生物工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]