抗肿瘤灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤的灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制备方法，该复合物为葡聚糖和蛋白质复合物，蛋白质含量为１３％，重均分子量为６．４６×１０↑［５］，在镉乙二胺水溶液中为较伸展的无规线团构象。该复合物是用麸皮的提取液为主要成分配制成培养基，由灵芝菌种深层发酵产生灵芝菌丝体，并用磷酸盐缓冲液从上述菌丝体中分离出糖蛋白复合物。该糖蛋白复合物对植入小鼠体内的爱氏腹水肿瘤（ＥＡＣ）的生长具有明显的抑制作用，而且无毒副作用，可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有抗肿瘤活性的糖蛋白复合物、该复合物的用途及其制备方法。最近的研究表明，植物多糖及其复合物对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓、肺炎等都具有显著的疗效。大量药理和临床研究表明，该多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，而且对正常细胞没有毒副作用。近年来，国内外的大量研究表明灵芝中具有抗肿瘤活性的主要有效成分是灵芝多糖。Mizuno等人(Nippon Nogeikagaku Kaishi 58，871，1984；59，1143，1985)及Sone等人(Agric.Biol.Chem.49，2641，1985)均报道灵芝子实体水溶性多糖具有明显的抗肿瘤活性。然而，由于灵芝人工栽培较为困难，周期较长，使得由子实体制得的灵芝多糖价格昂贵，难以推广。本专利技术的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制备方法，该方法是利用生物工程发酵技术培养灵芝菌丝体，并从中提取出具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白，并弄清楚它的一级和二级结构，所用方法简单易行、成本低廉。这种复合物可用于生产保健产品或进一步开发出新的天然药物。为实现本专利技术的上述目的所采取的技术措施是一种具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物，该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为13％，其重均分子量为6.46×105，在镉乙二胺水溶液(镉乙二胺饱和水溶液按1∶1的体积比与水混合)中为较伸展的无规线团构象，特性粘度和均方根旋转半径<S2>1/2的分子量依赖关系分别为=5.1×10-2Mw0.60和<S2>1/2=3.9×10-2Mw0.50。该糖蛋白复合物对植入小鼠(昆明种小白鼠)体内的爱氏腹水肿瘤抑制率的结果见附表1。显然，菌丝体糖蛋白的抗肿瘤活性明显高于子实体水溶性多糖，因此，该复合物可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保建品，具有极大的推广和应用前景。一种制备上述具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物的方法本专利技术采用灵芝菌种(购自华中农业大学食用菌基地)经液体培养后得到灵芝菌丝体，将此灵芝菌丝体分别用乙酸乙酯和甲醇回流后，用90％乙醇浸泡过夜，匀浆后离心，除去上清液，残渣用0.25M磷酸盐缓冲液(PBS)于70-90℃下提取，离心，收集提取液。提取液浓缩后，用Sevag法除去游离的蛋白质，重复多次，然后分别用清水和二次蒸馏水透析7-10天和3-5天。最后加入丙酮，沉淀出糖蛋白复合物。过滤分离出该糖蛋白复合物，并用无水丙酮洗涤，真空干燥得到白色粉状固体产品。所得菌丝体的产率为每升培养基60克。用红外、核磁共振、高效液相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确定了其化学组成和二级结构。该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为13％。其重均分子量为6.46×105，在镉乙二胺水溶液中为较伸展的无规线团构象。它的特性粘度和均方根旋转半径<S2>1/2的分子量依赖关系分别为=5.1×10-2Mw0.60和<S2>1/2=3.9×10-2Mw0.50。本专利技术所用的灵芝菌丝体菌种购自华中农业大学，深层发酵液体培养基是以农副产品麸皮的提取液为主要原料，培养基的组成如下麸皮提取液93％葡萄糖5％酵母提取物1％蛋白胨1％KH2PO40.05％K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.05％。与已有技术相比较，本专利技术科技含量高，且有明显的技术进步本专利技术提供的灵芝菌丝体多糖复合物为一种全新的物质，且具有抗肿瘤活性，由于弄清了其化学组成和二级结构，加之糖蛋白无任何毒副作用，这种灵芝菌丝体多糖复合物可望成为理想的和有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。该复合物的制备方法由于采用廉价的麸皮提取液为主要原料，利用生物工程发酵技术培养灵芝菌丝体，并从中分离出具有抗肿瘤活性糖蛋白，生产工艺简单、易行，生产周期较短，生产成本低廉，且糖蛋白产率也较子实体多糖高，因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。以下结合具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明实施例1灵芝菌种从华中农业大学食用菌基地购得。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞先在121℃消毒灭菌30分钟(空消)，再装入培养基在121℃消毒灭菌30分钟，斜放冷却使其凝固成斜面。然后在无菌室接种。斜面培养在恒温28℃以下进行，为期7天。液体培养基配方如下麸皮提取液93％、葡萄糖5％、酵母提取物1％、蛋白胨1％、KH2PO4O．05％、K2HPO40．0596、MgSO4·7H2O 0．05％。培养用的摇瓶(500 mL)和棉塞事先在121℃下消毒30分钟，装入液体培养基后再在121℃下消毒30分钟。冷却后在无菌室接种。将摇瓶置于摇床上，于28±1℃下震荡培养7天。所得的菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。120g灵芝菌丝体先用乙酸乙酯回流4小时脱脂，再用甲醇回流4小时。然后将其在90％乙醇水溶液中浸泡过夜。匀浆后离心，除去上清液。残渣用0．25M磷酸盐缓冲液(PBS，PH=7.0)在80℃时提取三次，离心，收集提取液。提取液浓缩后，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行5次，然后分别用清水和二次蒸馏水透析7天和3天。最后加入大量的丙酮，沉淀出糖蛋白复合物。过滤分离出的糖蛋白复合物用无水丙酮洗涤6次，再进行真空干燥，得到3g白色粉状圆体产品。产率为5％，重均分子量为6．46×105。附表1．灵芝菌丝体糖蛋白复合物的抗肿瘤活性比较权利要求1．一种灵芝菌丝体糖蛋白复合物，其特征在于该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为13％，其重均分子量为6.46×105，在镉乙二胺水溶液中为较伸展的无规线团构象，特性粘度和均方根旋转半径<S2>1/2的分子量依赖关系分别为=5.1×10-2Mw0.60和<S2>1/2=3.9×10-2Mw0.50。2．权利要求1所述的灵芝菌丝体糖蛋白复合物用于制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。3．一种制备权利要求1所述的灵芝菌丝体糖蛋白复合物的方法，其特征在于采用灵芝菌种经液体深层培养后得到灵芝菌丝体，将此灵芝菌丝体分别用乙酸乙酯和甲醇回流后，用90％乙醇浸泡过夜，匀浆后离心，除去上清液，残渣用0.25M磷酸盐缓冲液于70-90℃下提取，离心，收集提取液，提取液浓缩后，用Sevag法除去游离的蛋白质，然后分别用清水和二次蒸馏水透析7-10天和3-5天，最后加入丙酮，沉淀出糖蛋白复合物，过滤分离出的糖蛋白复合物用无水丙酮洗涤，真空干燥即得到灵芝菌丝体糖蛋白复合物。4．根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的液体培养基的组成为麸皮提取液93％、葡萄糖5％、酵母提取物1％、蛋白胨1％、KH2PO40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O 0.05％。全文摘要本专利技术公开了一种抗肿瘤的灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制各方法,该复合物为葡聚糖和蛋白质复合物,蛋白质含量为13%,重均分子量为6.46×10文档编号A61P35本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灵芝菌丝体糖蛋白复合物，其特征在于：该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为１３％，其重均分子量为６．４６×１０↑［５］，在镉乙二胺水溶液中为较伸展的无规线团构象，特性粘度［η］和均方根旋转半径〈Ｓ↑［２］〉↑［１／２］的分子量依赖关系分别为［η］＝５．１×１０↑［－２］Ｍ↓［ｗ］↑［０．６０］和〈Ｓ↑［２］〉↑［１／２］＝３．９×１０↑［－２］Ｍ↓［ｗ］↑［０．５０］。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张俐娜，陈敬华，余登寿，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]