产生内源标记的蛋白的方法技术

本公开内容提供了内源标记细胞中的内源蛋白的方法以及包含内源标记蛋白的细胞。本公开内容还描述了利用此类方法产生的细胞和包含具有标记的内源蛋白的细胞的试剂盒。

Methods of producing protein from endogenous markers

The present disclosure provides a method for an endogenous protein in an endogenous labelled cell and a cell containing the endogenous labelled protein. The present disclosure also describes the cells produced by this method and the kits of cells containing the labeled endogenous proteins.

【技术实现步骤摘要】
产生内源标记的蛋白的方法本案是分案申请，其母案的中国申请号是201180029160.3，国际申请号是PCT/US2011/032218，申请日是2011年4月13日。相关申请的交叉引用本申请要求于2010年4月13日提交的美国临时申请第61/323,702号、于2010年4月13日提交的美国临时申请第61/323,719号、于2010年4月13日提交的美国临时申请第61/323,698号、于2010年7月23日提交的美国临时申请第61/367,017号、于2010年10月7日提交的美国临时申请第61/390,668号、于2010年11月1日提交的美国临时申请第61/408,856号以及于2011年1月12日提交的美国临时申请第61/431,957号的优先权，其各自通过引用以其整体结合于本文。专利
本公开内容涉及标记内源蛋白的方法。专利技术背景蛋白标记广泛用于对细胞中的目标蛋白提供目视读出。在其它用途中，标记蛋白用于研究蛋白丰度和定位、转录调控和翻译调控、翻译后修饰、蛋白-蛋白相互作用、可变剪接、通过RNAi对RNA和蛋白的敲减以及转录因子结合位点。然而，在细胞中表达标记蛋白的目前方法导致失真的表达，其并不反映内源蛋白的表达模式。这是由于标记蛋白的表达往往依赖异源启动子用于表达。此外，一些标记蛋白异位表达自外遗传载体或随机整合至细胞基因组的载体，并因此不受内源调节途径控制。因此，对于可直接特异地整合至细胞的染色体中以产生通过内源调节途径控制的标记蛋白的方法存在强烈的需要。专利技术简述在一个方面，本公开内容提供标记至少一种内源蛋白的方法，所述方法包括：a)将以下物质引入细胞中：(i)至少一种靶向内切核酸酶或编码靶向内切核酸酶的核酸，所述靶向内切核酸酶结合靶位点并能切割编码所述内源蛋白的染色体序列中的切割位点；和(ii)至少一种包含标签序列的供体多核苷酸，所述标签序列被上游序列和下游序列侧接，所述上游序列和所述下游序列与所述染色体序列中切割位点的任一侧享有基本的序列同一性；和(b)将所述细胞保持在这样的条件下，所述条件使得通过所述靶向内切核酸酶在切割位点引入的双链断裂通过同源性定向的过程修复，使得所述供体多核苷酸中的标签序列被符合读框地整合至所述编码所述内源蛋白的染色体序列中，其中产生标记的内源蛋白。在另一个方面，本公开内容提供一种细胞，所述细胞包含至少一个被符合读框地整合至编码内源蛋白的染色体序列中的标签序列，使得所述细胞表达至少一种标记的内源蛋白。而在另一个方面，本公开内容提供监测内源蛋白的定位的试剂盒。所述试剂盒包含一种细胞，所述细胞具有至少一个被符合读框地整合至编码内源蛋白的染色体序列中的标签序列，使得所述细胞表达至少一种标记的内源蛋白。以下更详细地描述本公开内容的其它方面和重复内容。彩图的引用本申请文件包含至少一张以彩色完成的图片。含彩图的本专利申请出版物的拷贝将在请求并支付必要费用时由专利局提供。附图简述图1描述了TUBA1B基因座上标签序列整合的设计。(A)为显示了用于标签序列整合的靶区的染色体序列(SEQIDNO:29)、染色体靶区上的ZFN结合位点(带边框的核苷酸)、ZFN切割位点(黄色箭头)和标签序列整合位点(绿色箭头)的示意图。(B)为描述TUBA1B基因组靶区的示意图，其显示了编码区(红色)、非翻译区(蓝色)和ZFN切割位点(黄色箭头)。(C)为整合前TUBA1B基因组区域的DNA片段的示意图。(D)为含符合读框地与TUBA1B编码序列整合的GFP序列的TUBA1B基因组区域的DNA片段的示意图。(E)为所述标签序列成功整合后产生的在N端与GFP标签融合的内源α-微管蛋白的示意图。图2描述了包含被基因组微管蛋白序列侧接的GFP标签的供体质粒的图谱。图3描述了U2OS细胞中TUBA1B基因组区域的DNA序列(SEQIDNO:4)，其证明了GFP2编码序列被整合至微管蛋白编码区。带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示GFP2的编码序列，斜体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。图4描述了U2OS细胞中TUBA1B基因组区域的DNA序列(SEQIDNO:5)，其证明了RFP编码序列被整合至微管蛋白编码区。带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示RFP的编码序列，斜体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。图5出示了使用对TUBA1B基因座内GFP的靶定整合特异的引物对14个细胞克隆的接头PCR(junctionPCR)的琼脂糖凝胶电泳分析。图6显示了表达标记有GFP的内源α-微管蛋白同种型1B蛋白的单独分离的细胞克隆的微分干涉相差(DIC)显微术图像和荧光显微术图像的多个实例。(A)U2OS细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(B)U2OS细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(C)U2OS细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(D)A549细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(E)A549细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(F)K562细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白，(G)HEK293细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白和(H)HEK293T细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型1B蛋白。图7描述了包含被基因组微管蛋白序列侧接的RFP标签的供体质粒的图谱。图8显示了MCF10a细胞系中RFP整合至TUBA1B区的验证。该整合利用微管蛋白引物通过基因组PCR和接头PCR来验证。(A)显示存在1945bpRFP/微管蛋白融合物带的DNA印迹和(B)显示在几个克隆中RFP标签序列阳性整合至TUBA1B的基因组PCR(T.I.=靶定整合)。WtMCF10a细胞和含RFP整合的U2SO细胞系用作对照。图9描述了MCF10a细胞中TUBA1B区的确证序列，其证明了RFP序列的整合(SEQIDNO:8)。带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示GFP2的编码序列，斜体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。图10描述了RFP整合至MCF10a细胞的TUBA1B基因座以及RFP和GFP整合至U2OS细胞的相同基因座的PCR验证。野生型条带为452bp而靶定整合(T.I.)条带为1190bp。图11显示出在MCF10a克隆5中RFP的插入位点处的接头(junction)具有预期大小。左边接头的预期大小为453bp而右边接头的预期大小为4089bp。图12描述蛋白印迹，其检测含RFP标记的微管蛋白的MCF10a克隆5中RFP和微管蛋白的表达。图13证明了大于99%的野生型MCF10a细胞缺少红色荧光，而大于99%包含RFP标记的微管蛋白的MCF10a克隆5细胞有红色荧光。图14描述了包含RFP标记的微管蛋白的转染的MCF10a细胞的表型稳定性。(A)在P2的表达和(B)在P18的表达。DIC图像在左边而荧光图像在右边。图15描述了包含被基因组STAT3序列侧接的GFP标签的供体序列的图谱。图16描述的示意图显示了用于标签序列整合的STAT3区的染色体序列(SEQIDNO:27)、染色体靶区上的ZFN结合位点(黄色序列)、ZFN切割位点(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标记至少一种内源蛋白的方法，所述方法包括：a)将以下物质引入哺乳动物细胞中：(i)至少一种靶向内切核酸酶或编码靶向内切核酸酶的核酸，所述靶向内切核酸酶结合靶位点并能切割编码所述内源蛋白的染色体序列中的切割位点；和(ii)至少一种包含标签序列的供体多核苷酸，所述标签序列被上游序列和下游序列侧接，所述上游序列和所述下游序列与所述染色体序列中切割位点的任一侧享有基本的序列同一性；和(b)将所述细胞保持在这样的条件下，所述条件使得通过所述靶向内切核酸酶在所述切割位点引入的双链断裂通过同源性定向的过程修复，使得所述供体多核苷酸中的标签序列被符合读框地整合至所述编码所述内源蛋白的染色体序列中，使得产生标记的内源蛋白，其中所述内源蛋白选自肌动蛋白、微管蛋白、核纤层蛋白、人表皮生长因子受体2（HER2）和高泳动族A蛋白（HMGA）。

【技术特征摘要】
2010.04.13 US 61/323698;2010.04.13 US 61/323719;201.一种标记至少一种内源蛋白的方法，所述方法包括：a)将以下物质引入哺乳动物细胞中：(i)至少一种靶向内切核酸酶或编码靶向内切核酸酶的核酸，所述靶向内切核酸酶结合靶位点并能切割编码所述内源蛋白的染色体序列中的切割位点；和(ii)至少一种包含标签序列的供体多核苷酸，所述标签序列被上游序列和下游序列侧接，所述上游序列和所述下游序列与所述染色体序列中切割位点的任一侧享有基本的序列同一性；和(b)将所述细胞保持在这样的条件下，所述条件使得通过所述靶向内切核酸酶在所述切割位点引入的双链断裂通过同源性定向的过程修复，使得所述供体多核苷酸中的标签序列被符合读框地整合至所述编码所述内源蛋白的染色体序列中，使得产生标记的内源蛋白，其中所述内源蛋白选自肌动蛋白、微管蛋白、核纤层蛋白、人表皮生长因子受体2（HER2）和高泳动族A蛋白（HMGA）。2.权利要求1的方法，其中所述靶向内切核酸酶为锌指核酸酶。3.权利要求1的方法，其中所述细胞为人U2OS细胞、人MCF10A细胞、人SKOV3细胞或人iPS细胞。4.权利要求1的方法，其中所述内源蛋白在C端或N端标记。5.权利要求2的方法，其中所述锌指核酸酶结合与选自SEQIDNO:13、14、1、2、18、19、22、23、25和26的序列有至少约80%序列同一性的序列。6.一种哺乳动物细胞，所述细胞包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：D马尔科夫，N津泽，D瓦萨，张帆，张红艺，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US