高产率生产博安霉素的发酵法制造技术

本发明专利技术涉及一种高产率生产博安霉素（博莱霉素Ａ６）的方法，该方法包括向发酵培养基中加入博安霉素的末端胺体，然后发酵培养能够产生博安霉素的轮枝链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ），并从培养液中回收博安霉素。与现有方法相比，该方法的发酵产物中博安霉素的含量比例可提高２－７倍。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产率生产博安霉素的方法。博安霉素为一已知抗生素，属于博莱霉素(Bleomycin,BLM)族，即博莱霉素A6(Bleomycin A6)，其具有下式所示的结构 博莱霉素族的抗生素多数都具有抗肿瘤活性，首先在临床上应用的是博莱霉素(A2+B2为主)，主要用于治疗鳞状上皮癌，但其突出的缺点是肺毒性大，能够导致不可逆的肺纤维化。随后相继用于临床的有匹莱霉素(Pepleomycin,PEP)和平阳霉素(BLM A5)，但其品种还不多，就其活性和毒性来说，临床上仍然缺乏对某些肿瘤具有特异性抑制作用且毒副作用小，尤其肺毒性小的优良品种。临床研究证明博安霉素具有良好的抗肿瘤作用，对头颈部癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、食道癌都有较好的疗效，尤其对肝癌也有满意的疗效，而且肺毒性极低，也没有发现其对心肝肾的毒性，临床应用前景很好。由于博莱霉素族抗生素具有十分相似的结构，在微生物发酵中，多种博莱霉素族抗生素往往同时产生，博安霉素在其中所占的比例不高。许鸿章等(药学学报，V23(9):667-671,1988)报道了经发酵培养轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var.)72所产生的一系列博莱霉素族抗生素，其中博安霉素按重量计仅占博莱霉素族抗生素总量的约10％。为了降低生产成本，获得更高的博安霉素产率，迫切需要一种高产率地生产博安霉素的方法。本专利技术的目的是提供一种高产率地生产博安霉素的方法。为此，专利技术人通过深入研究，发现了一种高产率生产博安霉素的方法，该方法包括向发酵培养基中加入博安霉素的末端胺体，然后发酵培养能够产生博安霉素的属于轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的微生物，并从培养液中回收博安霉素。该方法的发酵培养液中博安霉素的含量比例按重量计占博莱霉素族抗生素总量的20-70％。所有能够产生博安霉素的属于轮枝链霉菌的微生物都在本专利技术之列。用于本专利技术的较好的微生物是轮枝链霉菌平阳变种(Streptomycesverticillus var.pingyangensis n.var.)，其中优选的菌株是轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)72，轮枝链霉菌平阳变种Q835。轮枝链霉菌平阳变种72为已知菌株，有关其形态特征、培养特征、生理特性、碳源利用和抗菌谱等已有文献记载(赵仪英等，微生物学报，19(4):361364,1979)。用于培养上述微生物的培养基中，可采用能够被其利用的营养源即碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被其利用的痕量营养物，这些成分可予先一次性地加入培养基中，或者间歇或连续地加入培养基中。培养方式可采用静态培养、摇荡培养、搅拌培养或其它方式，但对大量生产来说，优选的方式为浸没培养。培养条件(时间、温度、pH等)随菌种不同而异，也随培养基成分的变化有所不同，本领域技术人员能够根据具体情况选择。在发酵培养基中加入的末端胺体是指精胺盐(如精胺盐酸盐，精胺硫酸盐)或其粗品，或者含精胺盐的物质(这些物质可以是植物来源的，如玉米浆，所采用的玉米浆可以是经各种方法处理提高了精胺盐含量的玉米浆)。末端胺体的加入量为每1000升培养基加0.1-1千克(按精胺盐酸盐计)，优选的加入量为每1000升培养基加0.4-0.6千克(按精胺盐酸盐计)。当博安霉素在培养基中积累达到最大浓度时终止培养，根据其性质采用本领域公知的方法进行分离纯化。博安霉素可以游离的形式得到分离，也可以药学上可接受的盐的形式(如盐酸盐、硫酸盐或有机酸盐，尤其是盐酸盐的形式)得到分离，如果需要，可以用常规方法将博安霉素的盐形式转化成游离形式。任何能够从培养物中分离纯化博安霉素的方法均在本专利技术之列。一般可使用吸附、洗脱、柱层析、冷干等方法，这些方法在每一分离步骤中可以单独使用，也可以结合使用，在整个分离过程中还可以重复使用。吸附方法包括以活性炭吸附，大孔树脂吸附或离子交换树脂吸附等。大孔吸附树脂可以是非极性大孔吸附树脂，也可以是中等极性的大孔吸附树脂，还可以是高极性的大孔吸附树脂。离子交换树脂可采用弱酸性阳离子交换树脂或强酸性阳离子交换树脂。洗脱方法包括用酸性溶液洗脱、不同浓度的中性盐溶液洗脱、单一溶剂洗脱、混合溶剂洗脱或溶剂与无机盐的混合溶剂洗脱等。柱层析包括吸附柱层析、离子交换柱层析、离子排斥柱层析、亲合柱层析、分子排阻柱层析和反相柱层析等。下列实施例用来进一步说明本专利技术的方法。实施例1以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和琼脂2.0％(pH7.2-7.5)为斜面培养基，120℃下灭菌30分钟，制成斜面，置于37℃恒温室中3天至表面水分稍干，无杂菌生长时，接种轮枝链霉菌平阳变种72菌种孢子，于28℃培养8天。在多个500ml锥形瓶中分别装入100ml培养基(培养基组成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆饼粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃灭菌30分钟后，进行接种，28℃振荡培养48小时，将该培养物作为种子。准备500L发酵罐，投料体积200L，培养基组成与种子培养基相同，120℃灭菌30分钟，接种量为0.5％，在1∶1通气量，29℃，以及180～200转/分搅拌培养48小时，转种至2吨发酵罐，培养基的投料体积为1000L，加入0.6千克精胺盐酸盐。其培养基组成为淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆饼粉3.2％、玉米浆3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃连续灭菌后接种，接种量为15-20％。在罐温29℃，通气量1∶1至1∶1.5，搅拌速度145转/分培养7天，至pH7.5以上，效价达到高峰时终止培养。经高效液相色谱检测(色谱柱YWG C1810μ3.9×300mm；流动相A甲醇，B 5mM己烷磺酸钠加0.5％冰醋酸，用浓氨水调pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，发酵培养液中博安霉素的含量按重量计占博莱霉素族抗生素总量的70％。发酵培养液800升用草酸调pH至3.0，再用5NNaOH调pH至6.5。加入阳离子交换树脂122(H+型)13升，搅拌3小时。收集树脂，用无盐水冲洗后将树脂装入柱中用0.3N HCl洗脱，收集活性部份。用5N氢氧化钠调pH至6.5，将活性溶液通过大孔吸附树脂4006柱(柱床10升)脱盐，用10％丙酮(含0.01 N HCl)洗脱。收集活性部份，减压浓缩。浓缩液用氨水调pH至6.5，将其通过CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl冲洗后，再用0.1-1.0 N NH4Cl梯度洗脱，洗脱液总体积约相当于柱体积的15倍。按峰位收集，合并，经大孔吸附树脂4006柱进行脱盐操作后，冷冻干燥。得到10.5克蓝色博安霉素盐酸盐(含铜品)。实施例2以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和琼脂2.0％(pH7.2-7.5)为斜面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产率生产博安霉素（博莱霉素Ａ６）的方法，该方法包括向发酵培养基中加入博安霉素的末端胺体，然后发酵培养能够产生博安霉素的属于轮枝链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）的微生物，并从培养液中回收所说的博安霉素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许鸿章，张瑞，戴敦华，陈汝贤，石莲英，鲁敏，王丽菲，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]