用芽孢杆菌属菌株产生高光学纯度L-乳酸的方法技术

一种产生光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸的方法，该方法包括下列步骤：（１）培养能够从可同化的碳源产生光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸的芽孢杆菌属的微生物；和（２）从培养液收集光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是1996年10月26日提交的同题的专利技术专利申请的分案申请，原申请的申请号为96121927.0。本专利技术涉及用某种芽孢杆菌属菌株产生高光学纯度L-乳酸的方法。更具体地说，本专利技术涉及以低的价格产生高光学纯度L-乳酸的方法。本专利技术也涉及同时产生高光学纯度L-乳酸和杀虫毒素的方法。L-乳酸已用作产生聚乳酸(一种可生物降解的塑料)的起始物质。L-乳酸已在许多领域(包括食品和药物、酿造、制革以及光学材料)得以应用。本专利技术的细菌产生的杀虫毒素已引起人们的注意，因为它与习用的农业化学品不同，对人畜无害。当L-乳酸在产生聚乳酸中用作起始物质时，如Kulkarni等和Ohara所报道的，起始乳酸的光学纯度越高，所产生的聚合物的结晶程度越高。高结晶度的聚乳酸适用于弹性薄膜和纤维。如Sato等，和Yoshinaga等所提及的高纯度的乳酸可用作液态晶体。联合国食品和农业组织(FAO)以及世界卫生组织(WHO)推荐的用于婴儿喂养的乳酸是L-乳酸。因此，乳酸的L-异构体是有用的，并且需要高光学纯度。L-乳酸通常用发酵方法产生，所述发酵方法包括(1)使用粪链球菌的方法；(2)使用瑞士乳芽孢杆菌的方法；(3)使用Lactobacillus amylovororus的方法；(4)使用德彼利氏乳芽孢杆菌的方法；和(5)使用Lactococcus lactis的方法。以上(1)到(5)是用乳酸菌产生L-乳酸的方法。这些乳酸菌是高度营养缺陷型的，如Boer等报道的需要昂贵的培养基。昂贵的培养基增加了L-乳酸产品的价格。鉴于上述情况，人们报道了使用细菌而不是乳酸菌的方法。例如Tamada等描述了使用米根霉的方法。在这一方法中，培养时间长达40-50小时，导致低的生产效率。就乳酸的D-异构体而言，以上提到的参考资料(Appl.Microbiol.Biotechnol.，34149-153)中有用BacillusLaevolactis产生该异构体的报道。但这一方法不适于产生L-乳酸。JP-A-58-40093、JP-B-60-6200和USP5079164公开了用凝结芽孢杆菌产生L-乳酸的方法。然而，凝结芽孢杆菌与用于本专利技术的细菌相比，是高度营养缺陷型的，因此，需要昂贵的培养基。这种微生物产生的L-乳酸的光学纯度也比本专利技术的菌株产生的要低(＜70％)。也未发现能产生杀虫毒素的凝结芽孢杆菌。尽管在JP-A-3-27291中公开了用凝结芽孢杆菌的生产方法，但其中一点也未说明所产生的异构体的类型(L或D)和所产生的乳酸的光学纯度。在JP-A-2-76592中，公开了用芽孢杆菌菌株产生乳酸的方法，但说明书中没有公开用芽孢杆菌菌株实际产生乳酸。本专利技术的第一个目的是通过提供一种用属于芽孢杆菌属的特定菌株产生高光学纯度的L-乳酸的方法来给出上述问题的一种解决办法。本专利技术的第二个目的是提供一种使用某种芽孢杆菌属的菌株同时产生高光学纯度L-乳酸和杀虫毒素，从而降低高纯度L-乳酸总的生产价格的方法。本专利技术的第三个目的是提供一种用能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的新芽孢杆菌菌株产生高光学纯度L-乳酸的方法。本专利技术的第四个目的是提供一种能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的新芽孢杆菌菌株。在本专利技术的第一实施方案中，经培养至少一种属于芽孢杆菌属的菌株产生了光学纯度不低于70％的L-乳酸，所述的芽孢杆菌选自由炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株组成的组。用于本实施方案的芽孢杆菌菌株能够从可同化的碳源产生L-乳酸。在本专利技术的第二实施方案中，经培养至少一种菌株同时获得了光学纯度不低于70％的L-乳酸和一种杀虫毒素，所述的菌株选自由苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacilluslentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株组成的组。用于本实施方案的芽孢杆菌菌株能够从可同化的碳源产生L-乳酸和一种杀虫毒素。本专利技术的第三实施方案的特征是经培养能够从可同化的碳源产生L-乳酸的Bacillus sp.SHO-1(FERM BP-5682)菌株以低的生产价格产生了光学纯度不低于95％的L-乳酸。本专利技术的第四实施方案是一种能够以不低于95％的高光学纯度产生L-乳酸的微生物学新芽孢杆菌菌株。以下将详细描述本专利技术。用于本专利技术的第一实施方案中的菌株包括能产生光学纯度不低于70％的L-乳酸的属于炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的菌株。通过使用上述芽孢杆菌属的菌株，能够产生光学纯度不低于70％的L-乳酸。如Bergey’sManual of Systematic Bacteriology Vol.2(1986)，P.H.A.Sneath(ed.)，Williams & Wilkins，P1113所述，在这些微生物中，炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌非常相近，以致细菌学区分这些种很困难。这三个种显示出对卵黄卵磷脂酶反应阳性的共同特征。用于本专利技术的第二实施方案中的能同时产生高光学纯度的L-乳酸和一种杀虫毒素的芽孢杆菌属的菌株包括苏云金芽孢杆菌、幼虫芽孢杆菌、缓死芽胞杆菌(Bacillus lentimorbus)、日本甲虫芽孢杆菌和球形芽孢杆菌菌株。在本专利技术的第三实施方案中，用Bacillus sp.SHO-1(FERM BP-5682)(一种芽孢杆菌属新菌株)能够产生不低于95％的高光学纯度的L-乳酸。在以下第四实施方案中详细描述了这一新菌株。在第四实施方案中，使用了Bacillus sp.SHO-1(FERM BP-5682)菌株。这一菌株能以非常高的光学纯度产生L-乳酸。这一菌株是专利技术人按以下方法从牛奶分离到的将牛奶样品在BCP(溴甲酚紫)计数平板琼脂(Nissui Pharmaceutical，Co.，Ltd.)上制成条，然后将其置入BBL Gas Pak中，并于34℃培养24小时。在产酸的菌落周围琼脂平板的颜色由紫变黄。用接种环挑出显示出颜色变化的菌落中的细菌，再在新鲜的BCP计数平板琼脂上制成条。这一过程重复2-5次。将如此筛选出的菌落转移到含2％葡萄糖、1％酵母提取物、1％蛋白胨和3.5％磷酸氢二钾的10ml液体培养基中(用HCl调pH至7.0)，并于34℃下在GasPak中培养24小时。通过分析培养液体中包含的L-乳酸的光学纯度并选择以高光学纯度产生L-乳酸的菌株，可以荻得目标菌株Bacillus sp.SHO-1。按本说明书实施例中的方法进行液体培养基中L-乳酸的光学纯度分析。所获得细菌菌株基本上是纯的。Bacillus sp.SHO-1的细菌学性质如下(1)形态学形状杆状大小5μm长×2μm宽移动性+孢子形成+孢子囊无隆起形状椭圆位置中间至亚端(2)生理学革兰氏染色+过氧化氢酶活性+卵黄卵磷脂酶反应+吲哚产生-V.P.试验+可同化的糖葡萄糖+麦芽糖+果糖+蔗糖-乳糖+棉籽糖-甘露糖醇-以上性质说明菌株SHO-1属于芽孢杆菌属。就以上所列性质来说，菌株SHO-1与已知的芽孢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时产生光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸和一种杀虫毒素的方法，该方法包括下列步骤：（１）培养能够从可同化的碳源产生光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸和一种杀虫毒素的芽孢杆菌属的微生物；和（２）从培养液收集光学纯度不低于７０％的Ｌ－乳酸 和所说的杀虫毒素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小原仁实，矢幡雅人，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]