产生黄原胶的无毒力野油菜黄单胞菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质的细菌菌株，它保持着产生外多糖的能力。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及丧失了致植物病性质但基本上保持了产生外多糖(exopolysaccharide)，尤其是黄原胶能力的新型细菌菌株，特别是黄单胞菌属(Xanthomonas)的菌株，尤其是野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X.campestris pv.campestris)是十字花科植物的致植物病的革兰氏阴性细菌，它用于黄原胶的工业生产(Martin，1994，微生物学研究(Res.Microbiol.)1459 93-97)。这种外多糖经济上的重要性引起了许多关于参与此合成的基因的研究(Martin，1994，如上所述)。已经对致病性的许多决定因素作了描述(Dow和Daniels，1994，植物与动物中的细菌致病原因(In bacterial pathogenesis of plants andanimals)，JL Dangl编，Springer Verlag，Heidelberg)。其中有对植物组织具有水解活性的胞外酶。当负责这些酶输出的分泌系统失活时，野油菜黄单胞菌的菌株就失去了其致植物病的表型，而此与植物中非常减弱的症状有关(Dow和Daniels，1994，如上所述)。所描述的致病性决定因素中，外多糖似乎在疾病的早期显示出作用(Dow和Daniels，1994，如上所述；Katzen等人，1998，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1801607-1617)。同样地，野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中描述的hrpXc基因(Kamoun等人，分子植物微生物相互作用(Mol.Plant MicrobeInteract)522-33)参与抑制相容宿主植物的防御反应，因为这个基因的突变会导致特征性的坏死反应(过敏性反应，HR)。多种野油菜黄单胞菌致病变种中所描述的无毒力基因也参与细菌的致病性，因为含有对应于和引起HR反应的抗性基因的植物能够识别它们(Dow和Daniels，1994，如上所述；Yang等人，1995，分子植物微生物相互作用8627-631)。在参与黄单胞菌属致病性的其它基因中(Dow和Daniels，1994，如上所述)，已经描述了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的两个基因，它们的突变将引起其致病性的减弱，并且没有改变胞外酶和外多糖的累积水平(Osbourn等人，1990，分子植物微生物相互作用3280-285)。其它致病性决定因素包括多组调节胞外酶和外多糖合成的独立基因，其中有rpfA至H基因，它们的突变引起外多糖产生的降低；rpfN基因，是这些酶和外多糖合成的阻遏基因(repressor)；clp基因，它的突变引起致病性的下降以及外多糖产物的降低(Dow和Daniels，1994，如上所述)。最后，致病性的其它决定因素包括hrp基因。hrp(过敏性反应和致病性)基因对与相容植物有关的致病性和与抗性宿主有关的过敏性反应是至关重要的(Alfano和Collmer，1997，细菌学杂志1795655-5662)。在欧文氏菌属、假单胞菌属、Ralstonia属和黄单胞菌属的多种致植物病的细菌中，已经克隆了这些基因，并在不同程度上描绘了其特性，它们是相对保守的(Zurek和Bukowski，1998，Acta Microbiologica Polonica，47227-241；Alfano和Collmer，如上所述)，尤其是在野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(X.campestrispv vesicatoria)中(Huguet等人，1998，分子微生物学(Molec.Microbiol)291379-1390；Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396；Bonas，1994，如上所述)。而且已经将其中最保守的改名为hrc基因(Bogdanove等人，1996，分子微生物学，20681-683)。迄今为止所描述的hrp基因的功能中有它们的表达调控、引起宿主反应的蛋白质的产生、特异的分泌系统(“III型” )的组成以及周质葡聚糖的合成(Zurek et Bukowski，1998，Acta MicrobiologicaPolonica，47227-241；Mudgett et Staskawicz，1998，微生物学的当前观点(Current Opinion in Microbiology)1109-114；Lindgren，1997，植物病原学年评(Annu.Rev.Phytopathol.)35129-152；Alfano和Collmer，1997，如上所述；Bonas，1994，如上所述)。已经克隆了一组野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的hrp基因(Arlat等人，1991，分子植物微生物相互作用，4593-601)，但是没有测序。也已经报道，根据平板上菌落的外观，认为由转座子引起这些基因发生突变的菌株具有正常外多糖的产生。但是没有公布这些菌株中更为精确定量的黄原胶产生能力。另外，这些菌株中产生的突变在性质上不十分稳定，不适用于生产黄原胶的工业用途。具体地，所使用的转座子含有编码转座酶的基因(Simon等人，1989，基因(Gene)80161-169)，不排除估计大约以每世代10-6至10-3的频率发生转座子的切除事件(Berg等人，1989，Berg和Howe编著，可移动DNA(Mobible DNA)，美国微生物学会，华盛顿，879-926页；Craig，大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli andSalmonella)，Neidhardt编著，ASM出版社，华盛顿，2339-2362页)。另外，所使用的转座子含有抗生素新霉素和卡那霉素的抗性基因。最后，插入到这些菌株基因组中的转座子构成非同源性DNA元件，因为它不是该菌株基因组自身的元件。虽然，目前在欧洲没有因野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的致植物病性质而施加特殊的管理法规，但是由于与环境有关的原因，使用非致植物病的野油菜黄单胞菌来降低可能污染附近农学目的栽培的风险是非常可取的。使用常规的随机诱变技术来选择用于生产的这样的菌株是一个冗长乏味的过程，因为它必须包括分离非致植物病但又保持生产能力特性(即无次级突变)的菌株的高通量筛选。此外，使用产生改造的黄原胶(如US 5,514,791所描述的)或者已经提高了生产力的遗传修饰菌株是经过严格规定的(Theilleux 1998，Dictionnaire permanent bioéthique et biotechnologies，ed Législatives，第1595-1648页)。后者要求，尤其是对菌株中产生的对植物有危害的结构，在生产地区必须采用严格的防止扩散措施。因此，必要花费将具有负面的经济后果。因此，要求用于工业生产的野油菜黄单胞菌菌株稳定地缺失致植物病性质，但保留其黄原胶的生产能力特性。另外，由于法规以及为了简化由生物质中分离黄原胶所带来的垃圾处理，使用不含有编码抗生素抗性的异源基因的菌株是有用的。最后，根据法国和欧洲立法，优选使用通过自体克隆(autocloning)构建得到的菌株，即是它不含有自身遗传以外的任何DNA元件。本专利技术人的研究已经可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
细菌菌株，其已通过失活至少一个毒力基因而丧失致植物病性质，并保留产生外多糖的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J皮尔拉德，JL西蒙，P切瓦勒里奥，
申请(专利权)人：罗狄亚化学公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]