生物发酵生产γ－亚麻酸蛋白的方法技术

一种生物发酵生产γ－亚麻酸蛋白的方法，包括原始菌种的活化扩大培养、摇瓶震荡培养、一级发酵、二级发酵、三级发酵、脱水、烘干等工艺步骤，其菌种优良，生产量大，干菌体收率３．５－４．１％，脂肪酸２５－３９％，γ－亚麻酸２０－２４％，生产成本低，生产工艺原材料成本可降低５０－８０％，工艺先进科学、成熟，可大规模工业化生产，已达到１０－３０Ｔ的３－４级发酵水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及γ-亚麻酸蛋白的制备方法，尤其是涉及一种利用微生物发酵生产γ-亚麻酸蛋白的方法。
技术介绍
疾病是危害人类生命和健康的主要因素，尤其是心、脑血管病发病率之高，更为严重。我国患有不同程度的心、脑血管病就有一亿多人，糖尿病也是一个很严重的常见病，我国患此病的也有3000万人之多。γ-亚麻酸(γ-Linolenic and acid GLA)为高级多不饱和酸，属于花生多烯酸类物质(包括各类前列腺素、血栓素和白三烯等)，是调解细胞自身活动的细胞物质，他们参于调节心、脑血管、呼吸、肾、胃、肠、免疫、生殖以及中枢与神经系统的功能，化学名为十八碳三烯酸，在6，7；9，10；12，13碳原子之间具有双键的不饱和脂肪酸，全顺的共轭立体结构，分子式为C18H30O2。经过大量的研究证明血脂质的代谢紊乱是造成心、脑血管病的主要原因，而脂质的代谢紊乱与人体中前列腺素产生的多少有关，γ-亚麻酸是前列腺素的前体，又称人体必须脂肪酸，若体内γ-亚麻酸合成受阻或缺乏，则会引起生理不调，血脂升高，动脉硬化，血栓形成，高血压，糖尿病，癌症，肥胖症及皮肤老化。因此，及时补充γ-亚麻酸便可保证前列腺素的正常代谢，从而消除疾病，提高肌体免疫力，延长人的寿命。经大量药理试验，γ-亚麻酸为前列腺素E1的前体而发挥降低胆固醇的作用，增加胆固醇的极积性、水溶性，使之被酶分解；γ-亚麻酸可从血液中清除甘油三脂，减少了内源性总胆固醇和-脂蛋白的合成，防止胆固醇在血管壁上沉积形动脉粥样硬化，临床表明γ-亚麻酸对甘油三脂、胆固醇、β-脂蛋白下降的总有效率分别为81.5％、68.2％、64.8％；血栓素A2是内源性最强烈的血小板凝集剂和血管收缩剂，经γ-亚麻酸转化成的前列腺素是体内最强烈的抗凝剂和血管扩张剂，它能抑制和分离体内多余的血栓素，从而防止脑血栓、冠心病、血栓性脉管炎等疾病的形成，γ-亚麻酸促进前列腺素的合成，从而减弱了由于紧张、刺激引起的升压效应，有助于降低原发性高血压；γ-亚麻酸能促进 细胞分泌胰岛素，维持血液中胰岛素水平的稳定性和血糖的稳定性；据许多试验报导γ-亚麻酸有抗癌作用，对肿瘤的发生和发展有一定的防治作用；前列腺素有明显的抗溃疡作用，而γ-亚麻酸本身对胃粘膜有保护和修复作用，可防止胃出血，抑制胃酸的分泌；国内近年有些报导，γ-亚麻酸与二十碳五烯酸配合便会治疗爱滋病；γ-亚麻酸蛋白中含有超氧化物岐化酶(SOD)，减缓人体衰老，延长人的寿命。γ-亚麻酸作为具有生理作用药物的应用，已广泛受到国内外医学界的重视。γ-亚麻酸大多存在于多种植物种子和少数动物中，目前国内外γ-亚麻酸的生产主要来源于月苋草，月苋草油中γ-亚麻酸含量只有7％-8％左右。由于野生月苋草来源很少，人工种植生长周期长，耗费大量土地资源，原料的来源受到限制，远远满足不了越来越大的市场需求。因此，人们开始寻求研究γ-亚麻酸的新来源，利用微生物发酵法生产γ-亚麻酸，但由于采用的生产菌种不合适以及受到发酵工艺的限制，工艺水平始终处于试验室研究阶段，并未形成工业化生产规模。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种所选菌种优良、工艺先进科学、生产成本低、产量高的工业化生产γ-亚麻酸蛋白的方法。本专利技术的制备方法依次包括下列步骤a)原始菌种的活化原始菌种采用小克银汉霉，经诱变后编号为MA7，将原始菌种接种于PDA斜面培养基上，培养温度为25-28℃，培养时间为96-120小时；b)扩大培养将活化菌种转接于克氏瓶PDA培养基上进行培养，培养温度为25-28℃，培养时间为96-120小时；c)振荡培养将扩大种子接种于500毫升种子培养基中振荡培养，振荡次数120-130次/分钟，培养温度为28-30℃，培养时间为18-20小时；d)一级发酵将振荡培养好的种子按5％接种量接种到50-300立升发酵罐中，通风量为1∶0.4-0.5，罐搅拌230-250转/分，培养基为种子培养基，PH为5.8-6.0，温度为28-30℃，发酵周期18-24小时，待孢子发芽、菌丝伸展无杂菌，可转入二级发酵；e)二级发酵培养发酵罐为500-3000立升，采用种子培养基，PH为5.8-6.0，接种量为10％，通风量为1∶0.4-0.5，罐搅拌200-230转/分，温度为28-30℃，发酵时间为18-24小时，菌丝粗壮舒展无杂菌，可进行三级发酵；f)三级发酵将二级发酵好的菌种转接入三级发酵，罐容量为5-30T，采用发酵培养基，PH为5.8-6.0，接种量为8-10％，通风量为1∶0.3-0.4，搅拌次数为180-210转/分，发酵时间为120-144小时；g)出料、脱水发酵结束后，将发酵料放出，置于离心机中，进行离心脱水，料液弃掉，收集湿菌体；h)烘干、粉碎将湿菌体在60℃旋风烘干机中烘干，含水量低于13％以下为止，将烘干的菌体粉碎，细度为40-50目，即得γ-亚麻酸蛋白粉剂；其中，PDA培养基马铃薯汁20％ 葡萄糖2％ 琼脂2％；种子培养基蔗糖2-3％酵母膏0.5-1.0％玉米浆0.5-1.0％尿素1.0-1.5％ KH2PO40.1-0.12％ MgSO40.02-0.03％CaCO30.01-0.015％ VB10.00002-0.00003％；发酵培养基蔗糖10-15％ 酵母膏1.0-1.5％ 玉米浆1.0-1.5％尿素0.2-0.25％ KH2PO40.04-0.05％ MgSO40.02-0.03％CaCO30.1-0.15％ VB10.00003-0.00005％。将上述产品进行各种指标的测定(常规测定方法)1.含水量的测定(恒温称重法)2.油脂含量的测定索氏抽提法3.γ-亚麻酸测定产品经索氏抽提法，得到的油脂，经甲脂化后，进行色谱分析测定，气相色谱的分析条件GC-16A气相色谱仪，G-R3A数据处理机。色谱柱Φ3mm×2000mm，担 体chromosorbw 固定液5％J二酸二乙二醇聚脂(DEGS)，载 气N2流 量40mL/min检测鉴定器氢火燃柱 温190℃进样口温度240℃检测器温度240℃经检测，γ-亚麻酸含量达20％以上。本专利技术的优点如下1.菌种优良，生产量大本专利技术所采用的生产菌种为小克银汉霉Cunninghame//aechinulata AS3.2006，编号为MW7，该菌种生长较快，3天就形成孢子，培养温度为25-28℃，经深层工业化生产，在连续的三级发酵中，从小试到中试生产性能较稳，在10T以上发酵中都能获得较好的发酵水平，干菌体收率3.5-4.1％，脂肪酸25-39％，γ-亚麻酸20-24％，是目前生产γ-亚麻酸的高产菌株。2.生产成本低发酵工艺中，本专利技术采用普通食用蔗糖，价格成本可降低2-3倍，采用无机氮代替有机氮，可比其它的生产工艺原材料成本可降低50-80％。3.工艺先进科学，产量高本专利技术技术工艺成熟，在连续10吨位规模生产中，从一级发酵至三级发酵始终菌体收率在3.5-4.1％，油脂的含量25-39％，而γ-亚麻酸含量20-24％，都能保持稳定及较高的生产量。见表1 微生物发酵γ-亚麻酸收率 4.可大规模工业化生产本专利技术技术已达到10-30T的3-4级发酵水平，而目前国内的几家研究单位工艺水平都处于试验室研究阶段本文档来自技高网...

【技术保护点】
生物发酵生产γ－亚麻酸蛋白的方法，其特征在于：依次包括下列步骤：ａ）原始菌种的活化：原始菌种采用小克银汉霉，经诱变后编号为ＭＡ７，将原始菌种接种于ＰＤＡ斜面培养基上，培养温度为２５－２８℃，培养时间为９６－１２０小时；ｂ）扩 大培养：将活化菌种转接于克氏瓶ＰＤＡ培养基上进行培养，培养温度为２５－２８℃，培养时间为９６－１２０小时；ｃ）振荡培养：将扩大种子接种于５００毫升种子培养基中振荡培养，振荡次数１２０－１３０次／分钟，培养温度为２８－３０℃，培养时间 为１８－２０小时；ｄ）一级发酵：将振荡培养好的种子按５％接种量接种到５０－３００立升发酵罐中，通风量为１∶０．４－０．５，罐搅拌２３０－２５０转／分，培养基为种子培养基，ＰＨ为５．８－６．０，温度为２８－３０℃，发酵周期１８－２４小 时，待孢子发芽、菌丝伸展无杂菌，可转入二级发酵；ｅ）二级发酵培养：发酵罐为５００－３０００立升，采用种子培养基，ＰＨ为５．８－６．０，接种量为１０％，通风量为１∶０．４－０．５，罐搅拌２００－２３０转／分，温度为２８－３０℃，发酵时 间为１８－２４小时，菌丝粗壮舒展无杂菌，可进行三级发酵；ｆ）三级发酵：将二级发酵好的菌种转接入三级发酵，罐容量为５－３０Ｔ，采用发酵培养基，ＰＨ为５．８－６．０，接种量为８－１０％，通风量为１∶０．３－０．４，搅拌次数为１８０－２１ ０转／分，发酵时间为１２０－１４４小时；ｇ）出料、脱水：发酵结束后，将发酵料放出，置于离心机中，进行离心脱水，料液弃掉，收集湿菌体；ｈ）烘干、粉碎：将湿菌体在６０℃旋风烘干机中烘干，含水量低于１３％以下为止，将烘干的菌体粉碎 ，细度为４０－５０目，即得γ－亚麻酸蛋白粉剂；其中，斜面菌种培养基ＰＤＡ：马铃薯汁２０％葡萄糖２％琼脂２％；种子培养基：蔗糖２－３％酵母膏０．５－１．０％玉米浆０．５－１．０％尿素１． ０－１．５％ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．１－０．１２％ＭｇＳＯ↓［４］０．０２－０．０３％ＣａＣＯ↓［３］０．０１－０．０１５％ＶＢ↓［１］０．００００２－０．００００３％；发酵培养基：蔗糖１０－１５％　 　酵母膏１．０－１．５％玉米浆１．０－１．５％尿素０．２－０．２５％ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．０４－０．０５％ＭｇＳＯ↓［４...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉兰，刘丹，
申请(专利权)人：长春圣洁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]