哺乳动物培养细胞提取液和其调制方法以及使用了该提取液的无细胞系蛋白质合成方法技术

本发明专利技术提供一种至少包括使在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序的哺乳动物细胞提取液的调制方法、和用该方法调制的哺乳动物培养细胞提取液、以及使用了该提取液的无细胞系蛋白质合成方法。优选该无细胞系蛋白质合成方法包括在进行合成反应之前无细胞系蛋白质合成反应液中含有外来ｍＲＮＡ以外的成分的状态下的一定时间的保温工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用了哺乳动物培养细胞提取液的无细胞系蛋白质合成方法以及上述提取液的调制方法。
技术介绍
近年来，以人基因组为代表，很多生物的遗传信息正在被破解。这其中，作为后基因组研究，注意力被集中在对应这些遗传信息的蛋白质的功能分析或基因组创药。将对应这些遗传信息的蛋白质应用、利用于医药品等中，需要短时间内简单地合成很多种蛋白质。现在，蛋白质的生产方法中广泛利用的是通过基因重组技术，使用酵母或哺乳动物培养细胞等活细胞的表达系(下面有时称为“细胞系”)。但是，活细胞为了维持自身功能而有排除外来蛋白质的趋势，另外，活细胞如果表达细胞毒蛋白质，则由于细胞不能生育等，而有很多难以表达的蛋白质。另一方面，作为不使用细胞系的蛋白质的生产方法，已知有如下所述的无细胞系的蛋白质合成系，即，进行向细胞裂解液或提取液中加入基质或酶等过程等，在试管内备齐生物的遗传信息翻译系，使用编码目的蛋白的mRNA，重新构建可以按照希望的顺序使氨基酸结合必要的残基数的合成系。在这样的无细胞系蛋白质合成中，难以受到上述细胞系的蛋白质合成之类的限制，能够不切断生物的生命进行蛋白质的合成，另外，由于在蛋白质的生产中不伴随培养等操作，所以与细胞系相比，能够在短时间内进行蛋白质的合成。进而，在无细胞系蛋白质合成中，由生命体不利用的氨基酸序列构成的蛋白质的大量生产也成为可能，所以被认为是有希望的表达方法。作为提供到这样的无细胞系的蛋白质合成中的细胞裂解液或提取液，探讨使用各种生物来源的提取液，其研究在进展。作为无细胞系蛋白质合成用提取液，至今已知有很多，但是考虑到翻译后的糖链修饰等，由于可以在保持完全活性的状态下表达人蛋白质，所以希望是与人细胞在生物分类上血缘接近的哺乳动物培养细胞来源的提取液。目前，作为哺乳动物培养细胞来源的无细胞系蛋白质合成用提取液，报道有兔网织红细胞的系(例如，参照非专利文献1Pelham et al.，Eur.J.Biochem.67，247-256(1976))、中国仓鼠卵巢(CHO)系(例如，参照专利文献1特开2000-325076号公报)。但是，在兔网织红细胞系中，伴随着向兔皮下注射乙酰苯肼溶液，投药4～5天后从兔耳采血，然后伴随所谓调制溶解产物(lysate)的非常繁琐的操作。另外，在CHO系中，是在惰性气体环境中，通过使加压下的CHO减压而使细胞破碎，调制其提取液，但该方法在制作提取液时需要特别的装置或器械。进而，由于提取液调制时的细胞数量或气压、加压时间对无细胞系中的蛋白质合成能力产生很大影响，所以在条件设定中需要繁琐的操作。另外，在通过这样的方法得到的提取液中，能够合成的蛋白质的量极少，是可以仅通过引进已进行放射性标记的氨基酸测量其蛋白质合成活性的程度。所以，需要开发出调制容易且蛋白质合成量高的哺乳动物培养细胞来源提取液和其调制方法。
技术实现思路
本专利技术正是为了解决上述课题的专利技术，其目的在于，提供调制容易而且比以往蛋白质合成量高的无细胞系蛋白质合成用哺乳动物培养细胞提取液的调制方法和该哺乳动物培养细胞提取液、以及使用了该哺乳动物培养细胞提取液的无细胞系蛋白质合成方法。本专利技术人等为了解决上述课题而进行潜心研究，结果已至完成本专利技术。即，本专利技术如下所述。本专利技术之一是哺乳动物培养细胞提取液的调制方法，其至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。本专利技术之二是在本专利技术之一的调制方法中，进而还包括在使其急剧冻结之后解冻哺乳动物培养细胞，并离心分离。本专利技术之三是在本专利技术之一或二所述的调制方法中，急剧冻结是通过液氮进行的。本专利技术之四是在本专利技术之二或三所述的调制方法中，已急剧冻结的哺乳动物培养细胞的解冻是在-10℃～20℃的水浴或冰浴中解冻的。本专利技术之五是在本专利技术之一至四所述的任意调制方法中，提取用液是含有蛋白酶抑制剂。本专利技术之六是在本专利技术之一至五所述的任意调制方法中，哺乳动物培养细胞是淋巴瘤来源的培养细胞。本专利技术之七是在本专利技术之一至五所述的任意调制方法中，哺乳动物培养细胞是生殖巢来源的培养细胞。本专利技术之八是在本专利技术之七所述的调制方法中，哺乳动物培养细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)来源的培养细胞。本专利技术之九是在本专利技术之八所述的调制方法中，中国仓鼠卵巢(CHO)是CHO K1-SFM来源。本专利技术之十是哺乳动物培养细胞提取液，是采用本专利技术之一至九所述的任意调制方法调制的。本专利技术之十一是无细胞系蛋白质合成方法，使用了本专利技术之十所述的哺乳动物培养细胞提取液。本专利技术之十二是在本专利技术之十一所述的无细胞系蛋白质合成方法中，在使无细胞系蛋白质合成反应液的组成中除了mRNA以外的反应液进行保温的工序之后，添加外来mRNA，进行合成反应。本专利技术之十三是在本专利技术之十二所述的无细胞系蛋白质合成方法中，保温是在0℃～50℃下进行的。附图说明图1是表示实施例2的实验结果的图表，表示保温工序(在进行合成反应之前，在无细胞系蛋白质合成反应液中含有外来mRNA以外的成分的状态下的一定时间的保温)对合成量有无影响。图2是表示实施例2的实验结果的图表，表示保温工序的反应液组成和保持时间对合成量的影响。具体实施例方式本专利技术是从哺乳动物培养细胞进行提取来调制哺乳动物培养细胞提取液的方法，其较大的特征在于，至少含有使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。通过利用这样的方法调制哺乳动物培养细胞提取液，来比较在上述专利文献1中记载的以往的方法，可以在更缓和的状态下进行细胞的破碎，可以在不破坏无细胞系蛋白质合成中所必需的成分的情况下取出到细胞外，所以能够在无细胞系中很容易地调制蛋白质的合成量比以往高的哺乳动物培养细胞提取液。进而，通过本专利技术的方法，也能够防止来自使用器械等的RNase混入等，另外，没有在使用了表面活性剂等的试剂的细胞破碎法的情况下所担心的翻译反应那样的物质进入。在本专利技术的调制方法中，需要急剧地冻结在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞。在本专利技术的调制方法中，“急剧冻结”是指在10秒以下、优选在2秒以下使哺乳动物培养细胞冻结。这是因为，在没有急剧地使哺乳动物培养细胞冻结的情况下，在蛋白质合成中所必需的成分有可能失活，所以不能达到本专利技术的上述效果。作为如上所述使哺乳动物培养细胞急剧冻结的温度，通常为-80℃以下，优选为-150℃以下。这是因为，如果以超过-80℃的温度急剧冻结，蛋白质合成中必需的成分会失活，蛋白质合成能力降低。上述哺乳动物培养细胞的急剧冻结，例如可以通过使用液氮或液氦等惰性气体等来实现，而优选使用得到容易、成本低的液氮进行。在本专利技术的调制方法中，在从哺乳动物培养细胞进行提取时，只要至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序，则对其它工序没有特别限制。例如，可以利用在研钵中使用研棒磨碎的方法、使用杜恩斯匀浆器(dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠的方法等在从大肠杆菌或小麦胚芽等得到无细胞系蛋白质合成用的提取液时一直以来进行的各种方法，破碎哺乳动物培养细胞后进行提取，但哺乳动物培养细胞与从大肠杆菌或小麦胚芽等得到无细胞系蛋白质合成用提取液的情况相比，细胞的破碎更容易，进而在通过仅利用这种冻结、解冻的破碎法得到的提取液中，含有蛋白质合成所必需的成分并保持其活性，出于这一理由，能够得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种哺乳动物培养细胞提取液的调制方法，至少包括使悬浮于提取用液中的哺乳动物培养细胞急剧冻结的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木崇，江连彻，伊东昌章，东出将贤，远藤幸善，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]