一种高载量金属螯合亲和层析介质制造技术

本案涉及高载量金属螯合亲和层析介质，以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，在硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子，羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚连接有配基，配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合；本发明专利技术成功地在介质表面固载了双金属层，有效提高了金属亲和层析介质的固载量，这种改进方法简单，生产成本低，利于大规模推广应用。

A high load metal chelating affinity chromatography medium

This invention relates to a high load metal chelate affinity chromatography medium with silica microspheres as the core, the silica microspheres with pore, with carboxymethyl chitosan oligosaccharide molecules attached to the silica microspheres surface and the pore part of carboxymethyl chitosan oligosaccharide molecules complexed with metal ions to form a first layer of metal chelate, the remaining part of the bond with allyl glycidyl ether, allyl glycidyl ether with the ligand ligand complexation with second metal ions to form second layers of metal chelate; the invention successfully immobilized on the surface of a dielectric double metal layer, effectively improve the immobilization amount of metal affinity chromatography, the improved method is simple, the cost of production low, conducive to large-scale application.

【技术实现步骤摘要】
一种高载量金属螯合亲和层析介质
本专利技术涉及一种层析介质，具体涉及一种高载量金属螯合亲和层析介质。
技术介绍
蛋白质的高效分离纯化是生物制药、基因工程、生命科学研究等顺利开展的前提和基础，根据蛋白质自身的尺寸大小不同、溶解能力及所带电荷数的不同，纯化蛋白质的方法也不尽相同。其中，金属螯合亲和层析技术是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化，具有特异性强、金属离子可选择种类多、吸附目标蛋白相对稳定、层析柱可连续使用或再生等优势而日益受到人们的关注。金属螯合亲和层析介质主要由固体基质、螯合配基和金属离子三部份构成，而且这些组成部分都会对最终层析柱吸附分离蛋白质产生不同程度的影响。评价金属螯合层析介质性能的指标有很多，如粒径及其分布、流通性能、孔道结构及载量等，其中，载量是最重要的指标之一，用以表征介质的吸附性能。高载量介质能大大增加柱承载能力，提升纯化能力，降低分离纯化成本。但是，现有金属螯合亲和层析介质的结构单一，普遍存在蛋白载量较低，分离纯化效率不高的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种高载量金属螯合亲和层析介质。本专利技术的技术方案概述如下：以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，所述硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子；所述羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚连接有配基；所述配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合。优选的是，所述第一金属离子选自Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+中的一种。优选的是，所述第二金属离子选自Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+中的一种。优选的是，所述第二金属离子与所述第一金属离子的摩尔比为1∶8～10。优选的是，所述羧甲基壳寡糖分子的聚合度在5～15之间。优选的是，所述硅胶微球的粒径为30～100μm，所述孔道的平均孔径为8～12nm。优选的是，所述配基为亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸中的一种。本专利技术的有益效果是：本案专利技术涉及的金属螯合亲和层析介质选用比表面积大、孔道均匀、孔径较大的硅胶微球作为内核，可以提供较大的配基固载面积；用羧甲基壳寡糖分子附着于硅胶微球表面增加了硅胶微球的生物相容性，能够增加蛋白质载量；羧甲基壳寡糖分子是经羧甲基修饰的聚合度为5～15的低聚壳聚糖分子，其对Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+等金属离子具有强烈地络合作用，可以用于螯合金属离子，增加层析介质的金属固载量；羧甲基壳寡糖分子通过烯丙基缩水甘油醚键合配基，该配基可以是金属螯合亲和层析介质中常用的配基亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸等，该配基进一步固载金属离子用于分离纯化；本专利技术成功地在介质表面固载了双金属层，有效提高了金属亲和层析介质的固载量，这种改进方法简单，生产成本低，利于大规模推广应用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术提供了一种高载量的金属螯合亲和层析介质，通过下述实施例以及对比例具体阐述。实施例1制备过程如下：1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；2)将步骤1)所得的硅胶微球内核用去离子水冲洗，依次加入23g(约0.2mol)烯丙基缩水甘油醚、5g硫酸钠、5g氢氧化钠、100ml去离子水，在45～50℃下搅拌18小时，用去离子水洗净，干燥后得到活化后的硅胶微球内核；3)将步骤2)所得硅胶微球浸泡于2mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌3小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，所得硅胶微球内核表面的羧甲基壳寡糖分子络合有Ni2+；4)向步骤3)所得硅胶微球中加入42g(约0.22mol)氨基三乙酸、50mL乙醇和5gNaOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤、干燥，所得硅胶微球内核表面的通过烯丙基缩水甘油醚键合了金属螯合配基氨基三乙酸；5)将步骤4)所得硅胶微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时，过滤、洗涤、干燥得到最终固载有双金属层的金属螯合亲和层析介质。实施例2：实施例1中的步骤2)中2mol/L醋酸镍用相同量的醋酸铁代替，其余制备过程与实施例1一致，得到不同金属的双金属层螯合亲和层析介质。对比例1：1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；2)将步骤1)所得硅胶微球浸泡于3mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌5小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，得到以羧甲基壳寡糖分子固载单层Ni2+的金属螯合亲和层析介质。对比例2：1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；2)将步骤1)所得的硅胶微球内核用去离子水冲洗，依次加入1.9～2mol烯丙基缩水甘油醚、0.4～0.5mol硫酸钠、2.4～2.5mol氢氧化钠、250ml去离子水，在45～50℃下搅拌18小时，用去离子水洗净，干燥后得到活化后的硅胶微球内核；3)向步骤2)所得硅胶微球中加入42g(约0.22mol)氨基三乙酸、50mL乙醇和5gNaOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤、干燥，所得硅胶微球内核表面的通过烯丙基缩水甘油醚键合了金属螯合配基氨基三乙酸；4)将步骤3)所得硅胶微球浸泡于3mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌5小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，得到以配基固载单层Ni2+的金属螯合亲和层析介质。对比例3：市售以氨基三乙酸为配基的金属螯合亲和层析介质。为了测试上述实施例1～2以及对比例1～3所述的金属螯合亲和层析介质，在相同条件下进行蛋白质动态载量测试。将5.0mL介质装柱,连接到层析系统中，平衡缓冲液为0.02mol/L磷酸-0.15mol/L氯化钠-5mmol/L咪唑(pH7.5)溶液，分别以组氨酸标记的枯草杆菌蛋白酶和乳酸脱氢酶上样，流速为0.5mL/min,流穿液达到饱和后停止上样，以0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高载量金属螯合亲和层析介质，其特征在于，以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，所述硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子；所述羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚连接有配基；所述配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合。

【技术特征摘要】
1.一种高载量金属螯合亲和层析介质，其特征在于，以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，所述硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子；所述羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚连接有配基；所述配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合。2.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述第一金属离子选自Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+中的一种。3.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿欢欢，朱至放，
申请(专利权)人：苏州博进生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32