一种用微生物发酵技术生产透明质酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种用微生物发酵技术生产透明质酸的方法，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。该方法是利用自行分离的一株兽疫链球菌进行发酵，采用适合自行分离菌株的最优碳、氮、无机盐和营养因子比例的发酵醪，控制发酵过程中的时间、培养温度、ｐＨ值、溶氧浓度，将获得的发酵液用物理法除菌，接着用乙醇法沉淀，再用酶解结合异戊醇来除蛋白，最终用真空冷冻干燥法得到透明质酸。其特征是，通过对发酵醪中碳源、氮源、无机盐、营养因子等营养成分组成比例的优化和发酵过程中发酵时间、培养温度、ｐＨ值、溶氧浓度等条件的优化，以及透明质酸的提取和纯化技术中除菌、沉淀、除蛋白、干燥等步骤的优化，最终获得透明质酸成品，建立成一套高效、简便的透明质酸的发酵提取工艺体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronic acid简称HA)是广泛存在与动物和人体结缔组织细胞外基质中以及部分细菌中的一种高分子粘多糖。HA是通过葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)以β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替连接而成的直链大分子聚合物。电子显微镜下观察证实HA为一线性单链，在水溶液中扩展成随机的线圈状，线圈的直径约500纳米。由于直链轴上单糖之间氢键的作用，HA分子在空间呈刚性的螺旋柱型，柱内侧因有大量的经基而产生强的亲水性，溶液中的HA亲和水分约为其本身重量的1000倍，这种粘液体能象橡胶物一样被提起，但实际是溶液，能被稀释。随着对HA结构、性能、生物功能认识的深入，HA已成为细胞生物、病理、免疫学等领域的研究热点。因其高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为一种可吸收、可降解的生物材料，已广泛应用于临床医学及高级化妆品生产。近年来HA的需求与日俱增，表现出良好的市场潜力和广阔的发展前景，视其来源和提取方法的不同，分子量在((8-500)×105Da之间。国内目前有很多生产透明质酸的企业，但大都停留在第一代产品的研制和生产上(分子量80万道尔顿、蛋白含量0.5％)，生产方法主要采取从动物组织中生化提取的方法，难以规模化，且生产成本高，价格昂贵。我国对组织提取法工艺的研究已趋于成熟，但由于原料短缺，生产出的HA多用于医药研究领域，无法满足国内在化妆品及临床医学上的需求。如何能利用微生物发酵法实现大规模生产，降低成本，加速发酵法生产透明质酸的产业化、开发高纯度、高分子量的药用级透明质酸，是我国透明质酸产业化面临的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。该方法是利用自行分离的一株兽疫链球菌进行发酵，采用适合自行分离菌株的最优碳、氮、无机盐和营养因子比例的发酵醪，控制发酵过程中的时间、培养温度、pH值、溶氧浓度，将获得的发酵液用物理法除菌，接着用乙醇法沉淀，再用酶解结合异戊醇来除蛋白，最终用真空冷冻干燥法得到透明质酸。其特征是，通过对发酵醪中碳源、氮源、无机盐、营养因子等营养成分组成比例的优化和发酵过程中发酵时间、培养温度、pH值、溶氧浓度等条件的优化，以及透明质酸的提取和纯化技术中除菌、沉淀、除蛋白、干燥等步骤的优化，最终获得透明质酸成品，建立成一套高效、简便的透明质酸的发酵提取工艺体系。，它包括以下步骤将培养好的兽疫链球菌接种到发酵罐中，罐内的成分组成为葡萄糖浓度为41～45g/L，氮源浓度为22～25g/L，无机盐2.4～2.8g/L，发酵条件为时间27～31小时，温度34～37℃，pH值6.8～7.2，前期增大溶氧量、后期减少溶氧量，将生产好的发酵液进行提取和纯化，首先用三氯乙酸调节pH值到4.5～4.7，搅拌后离心，接着用体积比2.6～2.8∶1的乙醇沉淀18～19小时，将沉淀用0.3M的氯化钠溶解沉淀，42℃加入蛋白酶60～65mg/L，作用1.5～2.5小时，用乙醇回收，再用等体积的异戊醇除蛋白，用乙醇回收，干燥20～24小时，得到成品。一种优选方案，其中所述的氮源为蛋白胨或酵母粉，更优条件为蛋白胨。一种优选方案，其中所述的无机盐为磷酸氢二钾和硫酸镁。一种优选方案，其中所述的乙醇为95％乙醇或无水乙醇，更优条件为无水乙醇。一种优选方案，其中所述的蛋白酶为链霉蛋白酶。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术做进一步说明将培养好的兽疫链球菌按10％的接种量接种到发酵罐中，罐内的成分组成为葡萄糖浓度为42g/L，蛋白胨浓度为22g/L，磷酸氢二钾为2g/L，硫酸镁均为2.4g/L，发酵条件为时间27.5小时，温度35.8℃，pH值7.0，前期溶氧量2.5L/分、后期溶氧量3.0L/分，将生产好的发酵液进行提取和纯化，首先用三氯乙酸调节pH值到4.5，搅拌后6000rpm离心20分钟，沉淀用体积比1∶2.6的无水乙醇沉淀18.5小时，将沉淀用0.3M的氯化钠溶解，42℃加入链霉蛋白酶63mg/L，作用2.5小时，用2.6倍体积的无水乙醇回收，再用等体积的异戊醇除蛋白，用无水乙醇回收，真空冷冻干燥24小时，得到成品。权利要求1.本专利技术涉及，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。该方法是利用自行分离的一株兽疫链球菌进行发酵，采用适合自行分离菌株的最优碳、氮和无机盐比例的发酵醪，控制发酵过程中的时间、培养温度、pH值、溶氧浓度，将获得的发酵液用物理法除菌，接着用乙醇法沉淀，再用酶解结合异戊醇来除蛋白，最终用真空冷冻干燥法得到透明质酸。其特征是，通过对发酵醪中碳源、氮源、无机盐等营养成分组成比例的优化和发酵过程中发酵时间、培养温度、pH值、溶氧浓度等条件的优化，以及透明质酸的提取和纯化技术中除菌、沉淀、除蛋白、干燥等步骤的优化，最终获得透明质酸成品，建立成一套高效、简便的透明质酸的发酵提取工艺体系。2.根据权利要求1所述的透明质酸的发酵提取工艺，其特征在于，其中所述的氮源为蛋白胨或酵母粉，更优条件为蛋白胨。3.根据权利要求1或2所述的透明质酸的发酵提取工艺，其特征在于，其中所述的无机盐为磷酸氢二钾和硫酸镁。4.根据权利要求1～3中任一项所述的透明质酸的发酵提取工艺，其特征在于，乙醇为95％乙醇或无水乙醇，更优条件为无水乙醇。5.根据权利要求1～4中任一项所述的透明质酸的发酵提取工艺，其特征在于，蛋白酶为链霉蛋白酶。全文摘要本专利技术涉及，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。该方法是利用自行分离的一株兽疫链球菌进行发酵，采用适合自行分离菌株的最优碳、氮、无机盐和营养因子比例的发酵醪，控制发酵过程中的时间、培养温度、pH值、溶氧浓度，将获得的发酵液用物理法除菌，接着用乙醇法沉淀，再用酶解结合异戊醇来除蛋白，最终用真空冷冻干燥法得到透明质酸。其特征是，通过对发酵醪中碳源、氮源、无机盐、营养因子等营养成分组成比例的优化和发酵过程中发酵时间、培养温度、pH值、溶氧浓度等条件的优化，以及透明质酸的提取和纯化技术中除菌、沉淀、除蛋白、干燥等步骤的优化，最终获得透明质酸成品，建立成一套高效、简便的透明质酸的发酵提取工艺体系。文档编号C12P19/04GK101041843SQ20061006545公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日专利技术者张伟, 刘金龙, 周巍 申请人:张伟, 刘金龙, 周巍本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一种用微生物发酵技术生产透明质酸的方法，特别涉及透明质酸的发酵提取工艺体系的建立。该方法是利用自行分离的一株兽疫链球菌进行发酵，采用适合自行分离菌株的最优碳、氮和无机盐比例的发酵醪，控制发酵过程中的时间、培养温度、ｐＨ值、溶氧浓度，将获得的发酵液用物理法除菌，接着用乙醇法沉淀，再用酶解结合异戊醇来除蛋白，最终用真空冷冻干燥法得到透明质酸。其特征是，通过对发酵醪中碳源、氮源、无机盐等营养成分组成比例的优化和发酵过程中发酵时间、培养温度、ｐＨ值、溶氧浓度等条件的优化，以及透明质酸的提取和纯化技术中除菌、沉淀、除蛋白、干燥等步骤的优化，最终获得透明质酸成品，建立成一套高效、简便的透明质酸的发酵提取工艺体系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，刘金龙，周巍，
申请(专利权)人：张伟，刘金龙，周巍，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]