重组犬钩虫抗凝肽５突变体、其编码基因、其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一类具有抑制凝血因子Ｘａ活性的重组犬钩虫抗凝肽５突变体（ｒＡｃＡＰ↓［５］ｍ）及其编码基因。此外，本发明专利技术还公开了该重组多肽的制备及其在治疗血栓性疾病中的应用。优选的，本发明专利技术重组多肽具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２所示的氨基酸序列，由５４个氨基酸组成，分子量为６．１ＫＤ，包含８个半胱氨酸残基，与野生犬钩虫抗凝肽５相比，本发明专利技术重组多肽删去了２０余个氨基酸，分子量减小超过１／４，降低了免疫原性，而体外抑制ＦＸａ活性和体内抗血栓活性与野生犬钩虫抗凝肽５保持相当，因此本发明专利技术重组多肽作为药用可减少给予量，从而降低由于外源蛋白的进入而可能引发机体的一系列不良反应，本发明专利技术重组多肽可望成为一类新的治疗血栓栓塞性疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一类重组多肽及其编码基因，尤其涉及一类具有抑制凝血因子Xa(Factor Xa，FXa)活性的重组犬钩虫抗凝肽5突变体(rAcAP5m)以及编码该重组多肽的基因。此外，本专利技术还涉及该重组多肽的制备，包括该重组多肽表达载体的构建，将所构建的表达载体转化到宿主菌中，诱导重组多肽的表达并对所表达的多肽进行纯化；本专利技术另外还涉及该重组多肽在治疗血栓性疾病中的应用，属于生物

技术介绍
各种原因所引起的血管损伤会启动凝血反应，正常情况下血液凝固可防止进一步出血，但在许多病理条件下，过度的凝血会导致血栓形成，从而引发一系列血栓栓塞性疾病。凝血反应是一系列放大的级联反应，在反应过程中血浆中的多种丝氨酸蛋白酶被水解激活。凝反应可导致形成由纤维蛋白和细胞成分所构成的不溶物，从而进一步形成血栓(Mann，K.G.，Nesheim，M.E.，Church，W.R.，Haley，P.and Krishnaswamy，S.(1990)Blood 761-16.and Lawson，J.H.，Kalafatis，M.，Stram，S.，and Mann，K.G.(1994)J.Biol.Chem.26923357-23366)。FXa是内源性和外源性凝血途径的交汇点，它是一种丝氨酸蛋白酶，可裂解凝血酶原生成凝血酶。FXa是凝血酶原酶复合物的重要组成部分，它在钙离子存在下，与辅因子FVa在活化的血小板膜磷脂表面形成凝血酶原酶复合物。游离的FXa的催化活性是很低的，但是一旦形成凝血酶原酶复合物，FXa的活性会显着提高。凝血酶原被快速的裂解，大量的凝血酶在血管损伤部位聚集，最终形成血栓(Fuster，V.，Badimon，L.，Badimon，J.J.and Chesebro，J.H.(1992)New Engl.J.Med.326310-318)。抗凝血药物是血栓性疾病的治疗和预防中的重要药物(Kessler，C.M.(1991)Chest9997S-112S and Cairns，J.A.，Hirsh，J.，Lewis，H.D.，Resnekov，L.，and Theroux，P.(1992)Chest 10456S-481S)。但现有抗凝剂如肝素类、直接凝血酶抑制剂，在使用过程中均表现出严重的出血等副反应，限制了它们的应用。因此临床上迫切需要新的、更有效的、副作用更小的抗凝血药。FXa抑制剂可抑制凝血酶的生成从而抑制凝血，由于它不抑制已生成的凝血酶的活性因而极少引起出血副反应，一分子的FXa可催化生成大于1000分子的凝血酶，也就是说，血液中的FXa浓度较凝血酶低1000倍以上，FXa抑制剂发挥药效时的血药浓度较凝血酶抑制剂低得多。因此抑制FXa比抑制凝血酶产生的抗凝效果更好，出血及其它副作用更小，故FXa抑制剂已成为抗凝血药物研究的热点。嗜血动物如蜱、蝙蝠、水蛭、线虫、人虱等它们的唾液中都含有不同的具有克服宿主正常止血功能的物质来帮助它们吸食血液。因此可从它们唾液中提取特异性FXa抑制剂(K.Y.MUMCUOGLU(1999)J.Insect Physilol 421083-1087)。犬钩虫抗凝肽5(Ancylostoma caninum anticoagulant peptide，AcAP5)是从食血成年钩虫，犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)可溶性提取物中分离出来的一种肽类FXa抑制剂，由77个氨基酸组成，分子量8.7KD，已获得其重组产物rAcAP5。AcAP5是迄今为止报道的活性最强的多肽类特异性FXa抑制剂，能够抑制动脉、静脉血栓的形成(United States Patent5,427,937、6,534,629 et al.)。在犬冠状动脉血栓模型中，仅皮下给药一次就可维持药效6小时，与其它蛋白类FXa抑制剂相比，AcAP5的一个突出优点就是给药方便和作用持续时间长(Sam S.Rebello，Howard S.(2000)Thrombosis Research98531-540)。但AcAP5的分子量略为偏大(分子量8.7KD)，临床应用时，可能需要较大用量方能达到有效量，由此而来的结果可能会使其免疫原性提高，引发一系列不良反应。
技术实现思路
本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一类新的重组犬钩虫抗凝肽5突变体(recombinant Ancylostoma caninum anticoagulant peptide 5 mutants，rAcAP5m)，该重组多肽抑制FXa活性或抗血栓活性与rAcAP5相当，但其分子量较原AcAP5要低，作为药用则可减少外源蛋白的给予量，从而可能降低由于外源蛋白的进入而引发机体的一系列不良反应。本专利技术首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一类重组犬钩虫抗凝肽5突变体(rAcAP5m)，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抑制FXa活性或抗血栓活性或功能的多肽衍生物。优选的，本专利技术重组多肽rAcAP5m具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，由54个氨基酸组成，分子量为6.1KD，包含8个半胱氨酸残基，与rAcAP5相比，本专利技术重组多肽rAcAP5m删去了20余个氨基酸，分子量减小超过了1/4，降低了免疫原性，而体外抑制FXa活性和体内抗血栓活性与rAcAP5相当(见试验例1和2)，因此若作为药用则可减少外源蛋白的给予量，从而可能降低由于外源蛋白的进入而引发机体的一系列不良反应。由于这些优点，本专利技术重组多肽rAcAP5m有希望成为一类新型的治疗血栓栓塞性疾病的药物。本文中，所述的“多个”通常意味着2～8个，优选为2～4个，这些取决于犬钩虫抗凝肽5突变体三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。根据相关实验资料的分析研究，本专利技术人发现，在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基础上进行点突变产生的系列多肽，会增强多肽分子与FXa的结合能力和生物活性。因为突变后序列增加了与人凝血酶原(FXa的内源性底物)活性部位氨基酸序列的相似性。例如，可以在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基础上进行以下突变而产生出仍具有抑制FXa活性或抗血栓活性或功能的系列多肽将第3位的Try缺失掉；或将第22位的Leu替换为Glu；或将第23位的Pro替换为Asp；或同时分别将第22位的Leu替换为Glu、第23位的Pro替换为Asp；或将第31位的Phe替换为Ser。所以在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基础上所进行的替换、缺失或插入而获得的仍具有抑制FXa活性和抗血栓活性多肽衍生物应包括在本专利技术范围之内。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种编码rAcAP5m的cDNA序列。本专利技术所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类重组犬钩虫抗凝肽５突变体，其含有以下（ａ）或（ｂ）的氨基酸序列：（ａ）具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列；或（ｂ）将ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抑制ＦＸａ活性或抗血栓活性或功能的多肽衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王银叶，张晓雪，刘晓岩，李洁璇，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]