本发明专利技术提供了一种稳定、高产紫草素的新疆紫草紫红色细胞系，紫草素化合物含量可达培养物干重的６－８％，是野生天然新疆紫草的５－９倍。本发明专利技术还提供了一种该细胞系的培养技术及大规模快速生产该细胞系培养物的方法。该方法打破了常规的紫草细胞二步培养法，采用一步培养法进行紫草细胞培养物的培养，并由此实现了细胞悬浮培养及固体培养基培养相结合的方法对新疆紫草细胞进行生产，快速生产有效成分。该方法采用液－固培养相结合，通过液体培养制种，固体培养得到培养物，从中选择综合性状好的留种用于液体培养，如此反复。采用此种方法生产新疆紫草细胞与野生型相比生产周期大大缩短，并且质量稳定、有效含量高。并且，采用此种方法生产新疆紫草细胞不占耕地、不破坏新疆紫草野生资源，保护了生态环境，解决了新疆紫草资源短缺的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新疆紫草细胞系，本专利技术还涉及该细胞系的制备方法及其培养物的生产 方法。背荣技术紫草为唇形目紫草科的一种以根入药的多年生草本药用植物。我国紫草资源大体可分 为-新疆紫草(Arnebiaeuchroma (Royle) Johnst-)、硬紫草(Lithosperm咖erythrorhizon S. etZ,)、滇紫草(OnosmapaniculataBur. Et Fr.)、内蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.) 和西藏紫草(0nosma hookeri Clarke var. Longiflorum Duthie.)等类别。其中，新疆紫 草因色素含量高和药理作用好而成为商品紫草的主要来源。新疆紫草，习称软紫草，生长于海拔2500-4200米高的山野林丛中或向阳坡地，主要分 布于新疆、西藏等地。株髙15-35cm，外表紫红色，根粗壮。药用部分为其根部，药用成分为紫草素及其衍生物，主要包括紫草素、-二甲基丙烯酰阿卡宁、去氧紫草素、消旋乙酰阿卡宁、乙酰阿卡宁、e-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、消旋紫草素、e—羟基异戊酰阿卡宁、卜甲氧基乙酰紫草素、乙酰紫草素等，均属2, 4-萘醌类有机化合物。新疆紫草中所含的紫草素及其衍生物具有重要的药用价值。研究表明紫草素及其衍生 物具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗病毒、抗菌、消炎以及促进循环系统循环的作用。外用可治疗 皮肤癌、红斑狼疮、湿疹、带状泡疹和烧烫伤；内服可用于绒毛膜上皮癌、病毒性肝炎、肺 癌及肝癌放化疗的辅助治疗。同时，紫草素及其衍生物因具有色价高、附着力强以及吸收紫 外辐射功能强的优点，成为理想的天然红色素，国际上被誉为红色素之王。虽然我国紫草资源较为丰富，但因人们过度采集，野生紫草资源巳接近枯竭。但是在医 药产业中对新疆紫草所含的紫草素及其衍生物的需求量又较大，因而出现了严重的供需矛盾。 寻找到合适的新理紫草的繁殖方法，快速生产紫草素及其衍生物以满足市场需求，具有重要^^^^ 。目前，对新疆紫草组织培养方面的研究主要集中在两方面 一方面，从愈伤组织中筛选 出优良细胞系，用以生产有用的次生代谢产物；另一方面，利用组织培养技术，诱导并筛选 出优良品系，并进一步将其快速繁殖成完整植株。目前对于新理紫草的研究主要集中在前者， 但因其具有生产条件要求高，工艺复杂，流程长，生产成本高的缺点，因而该项技术的推广应用受到了极大地限制，有待于进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种高产紫草素的新疆紫草细胞系。本专利技术以新疆紫草(其 根、茎、叶，或者由种子萌发的无菌苗)作为外植体，诱导愈伤纽织，通过反复继代培养，得到三种新疆紫草细胞系白色系、黄色系、紫红色系；对3种细胞系分别进行继代培养， 通过对其生长速度、紫草素化合物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，紫草素化合 物含量最高的细胞系。从分离的细胞系中选择颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团块状的培养 物，即为本专利技术细胞系。本专利技术进一步对获得的紫红色细胞系进行继代培养和筛选,综合考察有效成分的含量以 及生长特征，最终获得了可以无限传代培养的稳定髙产新疆紫草细胞系。该细胞系具有以下特 征生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团块张，质地均匀、略偏硬，紫草素及 其衍生物含量为培养物干重的6-挑，培养周期30-35天。具体地说，可通过如下方法制备得 到上述细胞系1) 新疆紫草无菌苗的培育取天然新疆紫草的种子，己通过中国科学院研究所标本馆(国家 植物标本馆)鉴定，先用75%酒精浸泡10-30s，然后用1%的氯化汞溶液消毒8-12min，再用 无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在基本MS (配方建附表l)中添加10-30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基，23-25*0，无光照培养， 约10天种子即可萌发长出无菌苗。2) 愈伤组织的诱导和培养取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊 子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5ram长的小段，接种在N6 (配方见附表2)中添 加0. 2rag/L-0. 5mg/L IM、lmg/L-5mg/LKT、0. 6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，23-25" 暗培养，7-10天诱导出愈伤组织。3) 愈伤组织的继代筛选本专利技术通过对新疆紫草愈伤组织的诱导和培养得到了三种新疆雪莲细胞系白色系、黄 色系和紫红色系；对3种细胞系分别进行了继代培养，通过对其生长速度、紫草素及其衍生 物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，紫草素及其衍生物含量最高的细胞系。选取紫红色细胞系为原始细胞系，用目测法从固体培养基中挑选颜色较深、色彩鲜亮的 紫红色愈伤组织在N6 (配方见附表2)中添加0. 2mg/L-0. 5mg/L IAA、 lmg/L-5mg/L KT、 0.6g/L 琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上继续继代培养。为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时 接种块大小控制在3mra以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化，本专利技术经过近100代筛 选获得了可以无限传代培养的稳定高产新疆紫草细胞系。本专利技术的第二个目的在于提供上述新疆紫草细胞系培养物的继代培养方法，其所用培养 基为N6 (配方见附表2)中添加0.2mg/L-0.5mg/L IAA、 lmg/L-5mg/L KT、 0.6g/L琼脂及30g/L 蔗糖，pH值5.2-5.8,接种块为4-6咖，培养条件温度23-25"，无光照，培养时间30-35 天。继代时选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团块状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。此外还对培养物紫草素及其衍生物(e, 0 ' -二甲基丙烯酰阿卡宁、去氧紫草素、消旋乙酰阿卡宁、乙酰阿卡宁、e-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、消旋紫草素、e— 羟基异戊酰阿卡宁、1-甲氧基乙酰紫草素、乙酰紫草素等，均属2， 4-萘醌类有机化合物) 的含量进行考察，选择综合性状好的培养物继代。本专利技术的第三个目的在于提供一种大规模生产上述细胞系培养物的方法。本专利技术方法将液体摇床培养与固体培养相结合，包括如下步骤1)采用液体摇床培养的方法制种；2)培养物中生长旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的培养物留种，用于歩骤1)的摇床培养，其余收 获，得培养物。具体地说，可采用如下方法进行大规模生产用高产新疆紫草细胞系做种子，于装有150raL液体培养基的500mL培养瓶中悬浮培养， 液体培养基为N6 (配方见附表2)中添加0.2mg/L-0. 5mg/L IAA、 lmg/L-5mg/L KT、及30g/L 蔗糖，pH值5.2-5.8，接种量3-6* (W/V, g.fw/ml),培养条件温度为23-251C,摇床转速 J00~120 rpm，培养时间8-10天，无光照培养。从液体培养基中挑选生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，分散性好、颗粒均匀、无污染的 细胞团作生产用种，将其转移到固体培养基上培养，注意剔出颜色发暗、发白的细胞团，接 种的细胞团大小为4-6,,固体培养基为N6 (配方见附表2)中添加0.2呢/L-0.5mg/L IAA、 lmg/L-5rag/L KT、 0. 6g/L琼脂及30g/L蔗糖，pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新疆紫草紫红色细胞系，其通过如下方法制备获得：采用新疆紫草的种胚或种子萌发的无菌苗为外植体，经诱导愈伤组织并反复继代培养，从分离的细胞系中选择颜色鲜艳呈紫红色、结构致密，团块状的培养物，即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉石，
申请(专利权)人：大连普瑞康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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