一种增加滇紫草培养细胞紫草素含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种增加滇紫草培养细胞紫草素含量的方法。其操作步骤主要包括：１．滇紫草细胞的继代培养；２．滇紫草细胞的液体培养和超声波处理过程；３．紫草素含量测定过程。利用超声波对悬浮培养的滇紫草细胞进行刺激，是提高细胞紫草素含量的有效手段。本发明专利技术操作简便，效果良好，扩展性强，可运用到植物细胞大规模生物反应器上，用来提高有效次生代谢产物含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用超声波增加滇紫草培养细胞紫草素含量的方法。技术背景滇紫草(Omwwc^am'cwtowmBur. etFr.)主产云南，是云南省本地常用中草药，属紫 草科(Boraginaceae)植物，其根药用。主要有效成分为紫草素及其衍生物，这些成分不但 具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印 染工业。目前，滇紫草的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。而利用植物细胞大规 模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是将来生产植物药最直接、最 有效的手段。开展细胞培养技术来生产药用次生代谢产物，首先要获得一种能快速增殖细 胞的方法，以保证高效的生产效率，縮短生长周期，降低生产成本。超声波在生物学和医学诊断治疗上的应用已经有几十年历史，前人的一些研究结果表 明低强度的超声波刺激能够影响细胞的生长，使细胞膜和细胞器的形态发生变化，这些变 化可导致细胞代谢和膜通透性的改变。已有许多研究表明超声波能够提高酶以及微生物细 胞在反应器中的生物转化效率，但是生物反应过程中超声波的影响机理仍然不十分清楚， 大多数情况下认为是超声波的机械刺激强化了生物转化过程中传质和混合，甚至提高了酶 的活性，使细胞内代谢反应更加旺盛。过去有关超声波生物学效应的研究大多集中于人和 动物细胞及微生物，应用于植物细胞的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能有效提高滇紫草离体培养细胞紫草素含量的方法。该方法的操作步骤如下1) 滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA1.0mg/L + 2，4-D 0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25土1 。C，滇紫草细胞接种于继代培养 基后，避光培养，培养周期28-30天；滇紫草细胞继代培养的目的是为了获得足够细胞生 物量用于研究超声波对细胞紫草素合成的影响；2) 滇紫草细胞超声波处理a. 用超声波清洗器来实现对细胞的超声刺激作用；b. 将继代培养10天的细胞接种在装有40mL含lmg/L激动素(KT)的M10液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为25士1 °C，摇床转速110r/min，暗培养，细胞培养周期为 12 d;c.在细胞培养过程的第2—6天中，选取超声波功率80—200W、超声波处理时间1 —5 min，对滇紫草培养细胞进行超声波刺激；3) 超声波刺激后继续培养，直到完成12天的培养周期；4) 紫草素含量的测定取培养的滇紫草细胞培养液，3500r/min离心20min，回收的 沉淀物为鲜细胞，将鲜细胞转移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸点30—60 。C)，用 超声细胞破碎仪进行细胞破碎，然后在室温下振荡(110r/min)提取24 h，提取液用于测 定细胞中紫草素的含量。紫草素呈红棕色，用分光光度计测量，在520nm处有最大吸收峰。绘制标准曲线，得 到C二187.85X—2.09， R=0.9995，其中C为石油醚溶液中的紫草素浓度(mg/L)， X为该 测定溶液的吸光度值，R为相关系数。S= (CNV/W) X100%; P=1000SW其中，S为紫草素含量(％)， P为紫草素产量(mg/L)， W为愈伤组织干重(g/L)， V 为萃取液体积(L)， N为稀释倍数。(该测定方法为现有技术)本
技术实现思路
的关键点在于1.超声波功率的选取；2.超声波处理时间的确定；3.超 声波处理时刻的选取。以上关键点如能把握好，可以显著提高细胞紫草素的含量。本专利技术操作简便，效果良好，扩展性强，文中所述的超声波细胞处理法可运用到植物细胞大规模生物反应器上，用来提高有效次生代谢产物含量。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不是对本专利技术的限制。 实施例h1) 滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+ NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25士1 °C，滇紫草细胞接种于继代培养基 后，避光培养；2) 将继代培养10天的滇紫草细胞接种在装有40mL含lmg/L激动素(KT)的M10液 体培养基的100mL三角瓶中培养，培养温度为25士1 °C，摇床转速IIO r/min，暗培养；3) 在培养的第2天，对悬浮培养细胞施加功率为80W、时长为5 min的超声波刺激， 如附图说明图1所示，细胞经超声波刺激后，继续培养，直到完成12天的培养周期。4)培养结束后测定细胞紫草素的含量为1.1%，比不经过任何超声刺激的对照组提高 了20%。实施例2:1 )滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25士1 。C，滇紫草细胞接种于继代培养基 后，避光培养；2) 将继代培养10天的滇紫草细胞接种在装有40mL含lmg/L激动素(KT)的M10液 体培养基的100mL三角瓶中培养。培养温度为25士1 °C，摇床转速IIOr/min，暗培养；3) 在培养的第4天，对悬浮培养细胞施加功率为100W、时长为2min的超声波刺激， 细胞经超声波刺激后，继续培养，直到完成12天的培养周期；4) 培养结束后测定细胞紫草素的含量为1.2%，比不经过任何超声刺激的对照组提高 了31%。实施例3:1) 滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25土1 °C，滇紫草细胞接种于继代培养基 后，避光培养；2) 将继代培养10天的滇紫草细胞接种在装有40mL含lmg/L激动素(KT)的M10液 体培养基的100mL三角瓶中培养。培养温度为25士1 °C，摇床转速IIOr/min，暗培养；3) 在培养的第6天，对悬浮培养细胞施加功率为200W、时长为lmin的超声波刺激， 细胞经超声波刺激后，继续培养，直到完成12天的培养周期；4) 培养结束后测定细胞紫草素的含量为1.3%，比不经过任何超声刺激的对照组提高 了42%。 M10培养基成分如下表成分浓度(mg/L)成分浓度(mg/L)KN03680NaH2P04*2H2019Na2S042000CuCl2，2H200.15CaCl2500NaFe-EDTA2H3B031.6Sucrose50000Inositol100Kinetin (KT)权利要求1、，其特征在于该方法的操作步骤包括1)滇紫草细胞的继代培养使用继代培养基，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25±1℃，滇紫草细胞接种于继代培养基后，避光培养；2)将继代培养10天的滇紫草细胞接种在装有40mL含1mg/L激动素的M10液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为25±1℃，摇床转速110r/min，暗培养；3)在细胞培养过程的第2-6天中，选取超声波功率80-200W、超声波处理时间1-5min，对滇紫草培养细胞进行超声波刺激；4)超声波刺激后继续培养，直到完成12天的培养周期。全文摘要本专利技术涉及。其操作步骤主要包括1.滇紫草细胞的继代培养；2.滇紫草细胞的液体培养和超声波处理过程；3.紫草素含量测定过程。利用超声波对悬浮培养的滇紫草细胞进行刺激，是提高细胞紫草素含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加滇紫草培养细胞紫草素含量的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括：　１）滇紫草细胞的继代培养：使用继代培养基，培养条件为固体培养，ｐＨ值５．６，温度２５±１℃，滇紫草细胞接种于继代培养基后，避光培养；　２）将继代培养１０天 的滇紫草细胞接种在装有４０ｍＬ含１ｍｇ／Ｌ激动素的Ｍ１０液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为２５±１℃，摇床转速１１０ｒ／ｍｉｎ，暗培养；　３）在细胞培养过程的第２－６天中，选取超声波功率８０－２００Ｗ、超声波处理时间１－５ｍｉｎ，对 滇紫草培养细胞进行超声波刺激；　４）超声波刺激后继续培养，直到完成１２天的培养周期。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛锋，刘畅，刘迪秋，陈朝银，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]