【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备L-蛋氨酸和有机酸的方法。更特别是，本专利技术 涉及一种由L-蛋氨酸前体通过酶转化反应制备具有高产量的L-蛋氨酸和 有机酸的方法，所述酶转化反应来自通过根据本专利技术而制备的L-蛋氨酸 前体生产菌株的发酵而生产的L-蛋氨酸前体。本专利技术生产L-蛋氨酸的方 法比传统方法更环保并能对L-蛋氨酸进行选择性生产，目的是使用工业 上不同领域中的L-蛋氨酸作为食品、食物添加剂和医学供应品的原料以 及药物等。
技术介绍
蛋氨酸是人体内的一种必需氨基酸，其可以广泛用作食品和食物添 加剂并进一步用作医疗液体和医疗供应品的人造原料。蛋氨酸作为类似 化合物如胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并且同时用作半胱氨酸和牛黄酸的 人造原料。蛋氨酸还可以提供硫。S-腺苷蛋氨酸衍生自L-蛋氨酸并且在 人体内扮演了一个固定供应甲基的角色，并且还参与合成大脑内的神经 传递素。蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)可抑制脂肪堆积在肺里和 动脉里并且可降压、消炎、减轻肝脏疾病和缓解肌肉痛疼等。 蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸在体内的功能目前已知如下。 l)它能抑制脂肪在肺部和动脉...
【技术保护点】
一种生产Ｌ－蛋氨酸和有机酸的方法，其特征在于包括如下步骤： １）制备Ｌ－蛋氨酸前体产生菌株和通过发酵该菌株产生Ｌ－蛋氨酸前体；和 ２）采用该Ｌ－蛋氨酸前体作为底物，在存在转移酶的情况下通过酶反应产生Ｌ－蛋氨酸和有机酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR 2006-7-28 10-2006-0071581;KR 2007-7-27 10-2007-的范围 内。由于TF4076为需要蛋氨酸的菌株，而不能在体内合成蛋氨酸。在本 发明中，为了通过解除对蛋氨酸的需要性从而使将这种菌株作为蛋氨酸 生产菌株来使用，本发明者采用NTG人工突变制备解除了对蛋氨酸的需 要性的L-苏氨酸生产菌株五.coCJM002 。所述￡. co//CJM002被称为 大肠杆菌(&c/^/c/n'a cc //. )MF001并于2004年4月9日保藏在KCCM (韩国微生物保藏中心，友林大厦，弘济1洞，西大门区，首尔，361-221， 韩国)(保藏号KCCM-10568). O-琥珀酰基高丝氨酸通过上述方法产生制备的大肠杆菌(&c/^/c/^ co/O CJM-BTJ (pMetA-CL)也于2006年7 月21日保藏(保藏号KCCM- 10767)并且大肠杆菌(^c/zeWc/n'fl co//.) CJM-BTJ (pCJ-MetA-CL)在2007年7月5日保藏(保藏号KCCM-10872). O-乙酰基高丝氨酸通过本发明的上述方法产生制备的大肠杆菌(&c/zen'c/n'a co//.) CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL)于2007年7月5日保藏 (保藏号KCCM-10873)。上述制备的L-蛋氨酸前体生产菌株培养基可以通过现有技术中已知 的常规介质和条件实现。本领域人员易于理解根据所选择的菌株采用的 培养基的方法也容易调节。例如，该培养基方法包括但并不限于分批(batch)，连续培养(continous culture)和分批培养(fed-batch)。各种 不同的培养基方法在下面的参考文献中有描述生物化学技术由 James M. Lee撰写,Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.所述介质必须满足特定菌株的培养基条件。各种不同的微生物培养 基介质在下列文献中有描述普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)，美国细菌学会，华盛顿,，USA， 1981 。那些介 质包含不同的碳源、氮源和示踪原子。碳源举例为碳水化合物如葡萄糖,、 蔗糖,、乳糖,、果糖,、麦芽糖、淀粉、纤维素；脂类如大豆油、葵花油、 蓖麻油和椰子油；油脂酸如棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸；醇类如甘油和乙 醇；以及有机酸如乙酸。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为碳 源。氮源举例为，有机氮源如胨、酵母膏、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL) 和黄豆粉以及无机氮源如尿素、硫酸胺、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝 酸铵。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为氮源。这里的介质还 包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和以及相应的含钠盐作为磷酸盐的来源。 所述介质还包括金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，氨基酸、维他命以 及常规的前体也可以加进来。所述介质或前体可以分批处理或连续地加 入培养基中。培养基的pH在培养过程中通过以适当的方式添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来进行调节。在培养过程中 通过采用抗发泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的产生。为了维持 培养基的需氧条件，可将氧气或含氧气体(例如，空气)通入培养基中。培养基的温度通常在20-45 。C,优选为25 -40°C 。培养周期在L-蛋氨酸前 体的产量在达到所需水平之前一直是连续的，优选的培养时间是10-160 小时。步骤2)的过程包括经酶反应产生L-蛋氨酸和有机酸的过程，所用 的酶是具有活性的胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或0-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或在使用时含有这些酶的活性菌株。O-琥珀 酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸产自上述L-蛋氨酸前体生产菌株以甲 基硫醇作为底物。更特别的是，本发明提供了一种通过酶反应产生L-蛋氨酸的方法， 所用酶是胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高 丝氨酸硫化氢解酶，通过采用由上述方法作为底物积聚的高丝氨酸，0-含磷高丝氨酸，O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸。本发明优选 采用O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸作为底物。在本发明中，所述胱硫醚伽马合酶或0-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解 酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶可以衍生自埃希氏菌属(&c/^r/c/n^ 取)、假单胞菌属(尸M油腳mw 5p.)、钩端螺旋体菌属(丄e,—m印.)、 棒状杆菌属(Co，e6aen'謂s/7.)、酵母菌属(Sacc/i(3rom3;cep.)、色 素杆菌属(C7womo^e'謂)、奴卡氏菌属(7VocflWa 5^.) 、■博其万 特属(5ra命/n'zo6/訓w.)、生丝单胞菌属(//，/zo脂fl; .)、 甲基球 菌属(她^y/ococ，取)、Methylo杆菌属(Me鄉/o6腦'肠印.)、亚石肖化 单细胞菌属(煎my函omxs 5/ . ) 、 ^7e57'e〃fl 5/ .、杆菌属(_6ac〃/z )、 志贺氏菌属(5Tn'ge〃a sp. ) 、 Co/we〃/a sp.、妙、门氏菌属(Sa/mcwe〃a )、 酵母或真菌类。在步骤2)的过程中，其中O-琥珀酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体,优选采用的是衍生自假单胞菌属(Aew^ moww w.)、奴卡氏菌属 (7Vbcara^z J 或色素杆菌属(C/womo6flfen'Mm印.)的胱硫醚切卩马合 酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶, 更优选用的是衍生自 i^ewt/画oa51 、 鼻疽诺卡菌(jVocarJ/aFarc/m'ca )、 恶臭假单胞菌(尸sewt/o腳wflw) 或青色素杆菌在步骤2)的过程中，其中O-乙酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体，优选采用衍生自钩端螺旋体菌属(丄epto印/ra印.)、色素杆菌属 (C/wwwo6fle〃'MW印.)或生丝单胞菌属(T^/ /zomw7tw 5p.)的胱硫醚切口马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢角军酉每，更优选用存亍生自丄e/7^w/ /ra we^en'、 尸sewcio柳cwcw awz-ogewosfl 、//3^ /zowowfl51 jVe/7^#z/wm或青色素杆菌(C/2romo6ac/e厂/wm F/o/flceww)。 上述的酶反应如下列反应式所示，并且其结构式如图2所示。 CH3SH + 0-琥珀酰基-L-高丝氨酸 <=> 琥珀酸盐+蛋氨酸 CH3SH + 0-乙酰基-L-高丝氨酸 <=〉乙酸盐+蛋氨酸 在上述反应中，如图2公式所示，CH3S-甲基硫醇残基被O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的琥珀酸盐或乙酸盐残基取代以产生蛋氨酸在反应中甲硫醇(CH3SH)可以不同的形态加入。具有上述酶活性的基因编码酶序列可以从美国的NCBI数据库，和日本的DNA数据库(KEGG)中获得。为了生物转化反应，将获得的基因序列克隆，然后将其诱导加入到表达载体。待表达的酶以活性状态来自重组菌株。酶表达菌株和已表达的酶二者都可直接用于反应。从上述基因或微生物菌株表达的那些酶可以直接进行混合或部分混合或不混合，在发酵的上清或肉汁积聚L-蛋氨酸前体以开始反应。在本发明优选的实施例中，O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸积聚在 发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自假单胞菌属 (7^eMt/omowcw sp.)、色素杆菌属(C7^owo6en'wm sp. ) 、 f勾立瑞虫累方定^[本 菌属(丄印/cwp/r w.)或生丝单胞菌属(/fyp/zowomw印.)的胱硫醚伽马 合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解 酶。更优选地，O-琥珀酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成 蛋氨酸，所述酶是衍生白尸sewc owcwas awrogewoM 、 恶臭假单胞菌 (尸seWo腳mw戸f油)或青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)胱 硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。o-乙酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衫f生自丄ep^os/ Zn3 we_yer/、 i/y/ /zo柳oas 7Ve/ ^w/z/m或青色 素杆菌(C/zromo^cfeWwm Wo/flcewm)的胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高 丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。pCL-CJl载体(CJ，韩国)中的每个表达基因，E //的表达用载体，以 及被表达的蛋白从采用超声波降解法分解细胞制备的酶溶液中获得。所 述酶溶液加入积聚有O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的发酵 溶液，并将和甲基硫醇溶液也加入其中以开始反应。该反应采用DTNB (5，5-二硫基-双(2-硝基-苯甲酸，Sigma,美国)控制并且反应产物由HPLC 进行分析。在本发明中,在没有分离步骤下，通过CH3SH分别与O-琥珀酰基高 丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸反应可以额外得到副产物如琥珀酸或乙酸。附图说明本发明的优选实施例的应用参照附图可以很好地理解，其中 图1显示的是蛋氨酸前体生产菌株的基因处理图。图2显示的是步骤2中蛋氨酸产物的化学结构。图3是由pMetA-CL得到metA基因表达的原理图。.图4是由pCJ-MetB-CL得到metB基因表达的原理图。图5是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-琥珀酰高丝氨酸使用量。每种酶溶液的来源如下。酶溶液#21是一种不包含特定基因的细胞提取液。<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>图6是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-乙酰基高丝氨酸 使用量(consumptions)。每一数字如图5中所示。图7显示了用于转化反应的每种酶的氨基酸序列，按照DNAstar的 megalign排歹lj 。具体实施方式本发明实用的和当前优选的实施例如下所示。然而，本领域技术人员应当理解，鉴于本文的公开在本发明的精神和范围之内可对其进行修改和改进。实施例l:构建蛋氨酸前体生产菌株< l-l〉删除metB基因为了在五.co//菌株中删除编码胱硫醚合酶的metB基因，实施FRT 一步PCR删除(FRT-one-step PRC deletion)操作(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)。序列1和序列2的引物用于PCR ，采用pKD3载体(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)作为模板，导致缺失基因盒的结构。PCR操 作如下；在94。C变性30秒，在55 °C下退火30秒，在72 °C下延伸 l分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，之后对从1.2 kbp带获 得的DNA进行纯化。回收的DNA片段在co// (K 12) W3110中经电 穿孔与pKD46载体(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)转化。在电穿孔之 前，W3110在带有pKD46下，在30°C含有100吗/L的氨苄青霉素和5 mM的1-阿拉伯糖的LB介质中孵育，直至UOD6(K)达到0.6。然后用无 菌蒸馏水清洗培养基菌株2次，再用10%甘油清洗一次。在2500 V下电 穿孔。该回收的菌株在含有25叫/L的氯霉素LB平板介质中涂布，接着 在37。C下在培养基中培养过夜。然后，选择显示抗生素抗性的菌株。采用选择的菌株作为模板以及上述相同的引物在相同的条件下进行 PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中识别大小为1.2 kb的菌株从而确 认metB基因的删除。然后该菌株与pCP20载体(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)进行转化并在LB介质中孵育。最后构建成敲除(knock-out ) metB的菌株，其中metB基因在相同的条件下通过在1.0%琼脂糖凝胶 中PCR扩增，大小减至150bp。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株 称为W3-B。<1-2>删除thrB基因本发明者试图通过删除thrB基因编码高丝氨酸激酶来增加由高丝氨 酸到O-琥珀酰高丝氨酸的合成。特别是，采用苏氨酸生产菌株，由于采 用的高丝氨酸的活性非常强删除这种基因是相当必需的。为了从上述构建的W3-B菌株中删除thrB基因，通过上述删除metB基因相同的方法 进行FRT—步PCR删除。为了构建thrB缺失基因盒，采用pKD4载体(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)作为模板进行PCR扩增，所用的引物为序列3和序列4，如 下;在94 。C下变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72 。C下延伸1分 钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0M琼脂糖凝胶中进行电穿孔， 接着将得到的1.6 kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿 孔成W3-B菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有50吗/L 的卡那霉素的LB平板介质中涂布，接着在37 。C下在培养基中培养过 夜。然后，显示抗性的菌株被选择。采用选择的菌株作为模板利用序列3和序列4的引物在上述相同条 件下进行PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中选择大小为1.6 kb的菌 株从而确认ThrB基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并 在LB介质中培养。最终构建出thrB敲除(knockout)菌株，其中thrB 基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至150kb。 确认卡那霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BT。〈l-3〉metJ基因的删除为了删除metJ基因，其为包含在蛋氨酸前体合成中的metA基因的 调节基因，采用与删除metB基因相同的方法即FRT—步PCR进行操作。为了构建metJ缺失基因盒，PCR扩增使用序列5和序列6的引物， 如下；在94°C变性30秒，在55 °C下退火30秒，在72°C下延伸1 分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电穿孔， 接着将得到的1.2 kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿 孔成W3-BT菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素 的LB平板介质中涂布，接着在37 °C下在培养基中培养过夜。然后， 选择显示抗生素抗性的菌株。采用选择的菌株作为模板利用序列7和序列8的引物在上述相同条 件下进行PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中选择大小为1.6 kb的菌 株从而确认metJ基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并 在LB介质中培养。最终构建出metJ敲除(knockout)菌株，其中metJ 基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至600kb。 确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJ。<1-4-1〉过表达metA基因为了增加蛋氨酸前体的合成，metA基因编码参与O-琥珀酰高丝氨 酸合成中的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。采用￡. CO//w3110的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序 列9和序列10，如下；在94 。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在 72。C下延伸2分钟，循环以上操作25回。该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2 kbp带 的DNA进行纯化。回收的DNA片断与另一通过用Smal消化的pCL1920 载体中获得的DNA片断连接。//与所述连接的载体转化，接着置于 含有50吗/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构 建的载体称为pMetA-CL。 pMetA-CL的原理图如图3所示。W3-BTJ菌 株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pMetA-CL并且在那里观 察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。增加metA基因表达的另一个方法是，metA基因通过采用CJ1启动 子(CJ,韩国)和EcoRV与pCL1920载体连接。co//与接连的载体进 行转化，其接着置于含有50吗/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随 后经过选择。因而构建的载体称为pCJ-MetA-CL。 W3-BTJ菌株与所述 载体进行转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetA-CL并且在那里 观察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。<1-4-2> metX基因的过表达为了合成O-乙酰基高丝氨酸，metX基因编码参与O-乙酰基高丝氨 酸合成的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。采用丄印to^/m 的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序列11和序列12，如下；在94 。C变性30秒，在55 。C下退火30 秒，在72。C下延伸2分钟，循环以上操作25回。该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.1 kbp带 的DNA进行纯化。回收的DNA片段通过采用CJ1启动子和EcoRV连接 到pCL1920载体。E co/Z与所述连接的载体转化，接着置于含有50吗/L 的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为 pCJl-MetXlme-CL。 W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为 W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增 加。过表达metX基因的另一个方法是通过PCR扩增，采用棒状杆菌的 染色体作为模板，所用引物为序列68和序列69，如下；在94 。C变性 30秒，在55 。C下退火30秒，在72 。C下延伸2分钟，循环以上操 作25回。该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将DNA进行纯 化。回收的DNA片段通过采用CJl启动子和EcoRV连接到pCL1920载 体。^//与所述连接的载体转化，接着置于含有50吗/L的奇放线菌 素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为 pCJ-MetXcgl-CL。 W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为 W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增 加。<l-4-3>metA基因的删除 为了增加O-乙酰基高丝氨酸的产量，在W3-BTJ菌株中删除编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。基于发现只有metX基因诱导 导致O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，希望metA基因缺失带来O-乙酰基高 丝氨酸(表3)的积聚量的提高。为了删除metA基因，进行FRT —步 PCR操作。为了构建metA缺失基因盒，进行PCR扩增，所用引物为序列70 和序列71，如下；在94。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72 。C 下延伸l分钟，循环以上操作30回。该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2 kbp带 的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成五.co/ZW3-BTJ菌株 与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素的LB平板介质中 涂布，接着在37。C下在培养基中过夜。然后，显示抗性的菌株被选择。采用选择的菌株作为模板利用序列70和序列71的引物在上述相同 条件下进行PCR扩增。metA基因的删除通过在1.0%琼脂糖凝胶中确认 大小为1.1 kb的基因进行识别。然后该菌株用pCP20载体进行转化， 并在LB介质中培养。最终构建出metA敲除(knock out)菌株，其中 metA基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至 100kb。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJA。 W3-BTJA菌株与pCJ-MeTXlme-CL载体进行转化并将得到的菌株称为 W3-BTJA/pCJ-MetX-CL。该菌株在上述相同的方法下孵育，结果没有观 测到O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，但O-乙酰基高丝氨酸的产量相比较 W3-BTJ显著地增加了大约20%。<1-5> L-苏氨酸生产菌株的转化蛋氨酸前体生产菌株通过与所述实施例<1-1>到<1-3〉采用的 co//CJM002 (KCCM- 10568)相同的方式构建，该L-苏氨酸分离于所需的 蛋氨酸。构建的菌株分别称为CJM-BTJ， CJM-BTJ/pMetA-CL和 CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL。该metA基因敲除(knock-out)菌株还可以通过<1_4-3>中采用CJM-BTJ菌株相同的方式进行构建，以及所得菌株被称 为CJM陽BTJA。实施例2:发酵产生L-蛋氨酸前体<2-1>瓶装培养基实验为了检测实施例1中构建的菌株的蛋氨酸前体产量的能力，釆用锥 形瓶培养基操作。W3-BTJ、 CJM-BTJ禾H W3-BTJ与metA禾卩metX的 表达载体进行转化在含有奇放线菌素的LB平板介质中31°C下孵育过 夜。单菌落与含有奇放线菌素的LB介质3ml接种，随后在在31°C下 孵育5小时。该培养溶液是在含有25ml的蛋氨酸前体产生介质的250 ml锥形瓶中以200倍稀释，随后在31 °C下培养，200 rpm时间是64小 时。采用以比较蛋氨酸前体产生能力(表2和表3)。结果是，在蛋氨 酸前体生产菌株中蛋氨酸的产生能力显著增加，该蛋氨酸前体生产菌株 由L-苏氨酸生产菌株制备分离于所需要的蛋氨酸。<table>table see original document page 32</column></row><table>表2]由瓶装培养基得到的蛋氨酸前体(O-琥珀酰高丝氨酸)产物<table>table see original document page 33</column></row><table><2-2>大规模发酵实施例1中的菌株显示了最高的蛋氨酸前体生产能力，被选作批量生产蛋氨酸前体，其随后在5 L发酵器中发酵。CJM-BTJ/pCJ-metA-CL 或CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL接种在含有奇放线菌素的LB介质中， 随后在31°C下孵育过夜。然后，单菌落与含有奇放线菌素的LB介质 10ml接种，其在31°C下孵育5小时。该培养溶液在含有200ml的蛋 氨酸前体种子介质的1000 ml锥形瓶中稀释IOO倍，随后在31 。C下培 养，200 rpm时间是3-10小时。该培养液在5 L发酵器中接种，在接下 来经分批补料(fed-batch)发酵中进一步培养50-100小时。在发酵液中 该蛋氨酸前体的浓度经HPLC测量，结果显示在表5中。用于蛋氨酸前体产物的发酵器介质混合物<table>table see original document page 34</column></row><table>表5]发酵器中的蛋氨酸前体产物<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>实施例3:蛋氨酸转化酶产物<3-1>衍生自//的胱硫醚伽马合酶克隆对衍生自//的胱硫醚伽马合酶编码的11^18基因，其可用 于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或0-乙酰基高丝氨酸转移为 蛋氨酸。PCR扩增采用E co//的染色体作为模板，所用引物为序列13和序 列14，如下；在94 。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72 。C下 延伸2分钟，循环以上操作25回。得到的DNA片段用Ncol/Hind111消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ,韩国)。得到的载体称为pCJ-MetB-CL，其原理图如 图4所示。￡.co//W3110用克隆的载体转化，然后在含有50吗/Lof奇 放线菌素的LB平板介质中培养，随后经菌落选择。该选择的菌落在含有 50 (ig/L of奇放线菌素的3 ml LB介质中接种，随后在37°C下孵育过夜。 回收培育的细胞，用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.5)冲洗干净，在200 ^1 的磷酸钾缓冲液中悬浮,并用超声波降解法破碎5次间隔时间为30秒。该 细胞溶解物在12,000 rpm下离心分离10分钟并取所得的上清液采用 Bio-Rad蛋白质定量溶液(BIO-Rad,USA)量化整个蛋白质的量。该蛋白 表达通过SDS-PAGE识别。从细胞提取物中得到的上清液用于酶转化反 应。<3-2> 0-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶衍生于假单胞菌属 (尸sewc/o附ofls印.)克隆对衍生自假单胞菌属(i^Womow^.)的O-琥珀酰高丝氨酸 硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰 高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。作为假单胞菌属(尸sewfitomowoy 577.)微生物,尸sewc omo(XS1 aerag/osa禾口恶臭假单胞菌(尸sez^/o歸flsp她Wa)被米用。PCR扩增采用每 一 菌株的染色体作为模板，i^eM&wowcw ^n《/wa^时所用的引物为序列15和序列16以及恶臭假单胞菌(/^ez^omowMpwfi a)时所用的引物为序列17和序列18， 如下；在94 。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72。C下延伸2分钟，循环 以上操作30回。得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl 载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<1-1〉描述的相同的方法克隆的载体， 得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-3>衍生自假单胞菌属(尸w&mo似印.)的O-乙酰基高丝氨酸 硫化氢解酶克隆对衍生自假单胞菌属(尸M^omomw，)的O-乙酰基高丝氨酸 硫化氢解酶编码的metY基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰 高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用户seMfomomw aerwg/o^的染色体作为模板，所用引 物为序列19和序列20， 如下；在94 。C变性30秒，在55 。C下退火 30秒，在72。C下延伸2分钟，循环以上操作30回。得到的DNA片段用Ndd/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克 隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-4〉衍生自谷氨酸棒杆菌(Cor戸6flm'騰g/幽m/cMm)的胱硫 醚合酶克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用 于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列21和序列22，如下；在94。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72。C 下延伸2分钟，循环如下操作30回。得到的DNA片段用NcoI/HindUI消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克 隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-5>衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的 metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰 基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列23 和序列24， 如下；在94。C变性30秒，在55 。C下退火30秒，在72 。C下扩展2分钟，循环以上操作30回。得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克 隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-6>衍生自钩端螺旋体菌属a印fo^/m平)的O-乙酰基高丝氨 酸硫化氢解酶克隆对衍生自丄印tos; /ra meyen'的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编 码的metY基因，其可用于将作为蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用Z印to^/rameyen'的染色体作为模板，所用引物为序 列25和序列26， 如下；在94。C变性30秒，在55 °C下退火30秒， 在72。C下延伸2分钟，循环以上操作30回。得到的DNA片段用Ndd/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克 隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-7>衍生自Saccharomycessp.的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶克隆对衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的O-乙酰基高 丝氨酸硫化氢解酶编码的met25基因，其可用于将作为蛋氨酸前体的0-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体作为模 板，所用引物为序列27和序列28，如下；在94。C变性30秒，在55 。C 下退火30秒，在72。C下延伸2分钟，循环以上操作30回。得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的 pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1〉描述的相同的方法克 隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。<3-8〉衍生自色素杆菌属(C^owo6aen'wm 的O-琥珀酰高丝 氨酸硫化氢解酶克隆对衍生自青色素杆菌(C/^omoZ)aen.MW Wo/acewm)的O-琥珀 酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的 O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。PCR扩增采用青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)的染色体 作为模板，所用引物为序列29和序列30，如下；在94。C变性30秒，在 55 。C下退火30秒，在72。C下延伸2分钟，循环以上操作30回。得到的DNA片段用Nd...
【专利技术属性】
技术研发人员：金素影，赵光命，申容旭，严惠媛，崔炅旿，张真淑，赵英郁，朴英薰，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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