一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用，具体涉及三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。本发明专利技术所述多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73制备的工程菌，可用于去除污水中的磷元素，其中菌株M15/pQE30a‑ppk44T是其对应对照菌株去磷量的7倍，10h聚磷率高达70％。

A polyphosphate kinase gene and its application in dephosphorization of sewage

【技术实现步骤摘要】
一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种多聚磷酸盐激酶基因及在污水除磷中的应用。
技术介绍
水体富营养化已成为全球问题且日趋恶化，近年来，大量的氮、磷、钾等元素被排入各种水体的速度远远超过其被消耗速度，水体的有机物不断积累，水生生态平衡被打破，水体富营养化已成为全球问题并日趋恶化(YangX.E,WuX.,HaoH.L.,HeZ.l.Mechanismsandassessmentofwatereutrophication[J].JournalofZhejiangUniversityB,2008,3(3):197-209)。在所有的营养元素中，磷对藻类生长尤为重要，以磷为限制因子，当总磷浓度超过0.1mg/L，藻类就会过度繁殖(林晓,刘蜻,徐厚坤.富营养化水体中磷的控制方法初探[J].城镇供水,2003,2(1):29-30；AbellJ.M.,D.,HamiltonD.P.NitrogenandphosphoruslimitationofphytoplanktongrowthinNewZealandlakes:implicatiosforeutrophicationcontrol[J].Ecosystems,2010,13(7):966-977)。然而，无限制排放的磷进入水体生态系统后，还会发生复杂的吸附、固定和再释放过程，使污染水体更加难以治理(郑金伟,冉炜,钟增涛,何健.增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展[J].应用生态学报,2004,15(8),1487-1490)。磷是引起水体富营养化的重要因素，除去水体中积聚的磷是水体修复中亟待解决的关键问题。聚磷菌的发现为解决水体中无机磷的富集问题起到了至关重要的作用，国内外学者相继筛选了很多具有聚磷能力的微生物，一般都是从高度富营养化水体的沉积物或活性淤泥中筛选得到，蔡天明等从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株PseudomonasgrimontiiC18，在好氧培养24h后除磷率达94.1％(蔡天明,陈立伟,吴守中,钱丽花,任倩.1株脱氮除磷菌的筛选及其特性研究[J].环境科学,2010,31(10):2487-2492)。庄志刚等从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌—Alcaligenessp.ZGED-12，经优化培养条件后对磷的去除能力可达80％(庄志刚,韩永和,章文贤,周志华,陈佳兴,李敏.高效聚磷菌Alcaligenessp.ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性[J].环境科学学报,2014,34(3):678-687)。但是目前对红树林土壤聚磷菌的研究鲜见报道，红树林为潮滩湿地生物群落，长期遭受海水周期性浸淹，其生态环境与聚磷菌的聚磷过程好氧-厌氧交替环境高度一致，蕴藏着丰富的聚磷微生物资源。本申请专利技术人随机采集了东寨港红树林134份土壤样品，总共获得185株初筛菌株，有42株菌株的聚磷能力达到20％以上，其中Acinetobacter.tandoiiSC36最高聚磷率可达到70％，这些菌株可为富营养化水体的快速、高效处理提供了有效的菌种资源。
技术实现思路
本专利技术中聚磷菌株Acinetobacter.tandoiiSC36的16SrRNA基因序列已由专利技术人提交到GenBank数据中，其序列号为KU353550(GenBank:KU353550.1)。本专利技术提供三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、ppk73的DNA序列分别具有如SEQNO1、SEQNO2和SEQNO3所示的核苷酸序列。本专利技术的另一实施方案提供三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQNO4、SEQNO5、SEQNO6所示的氨基酸序列；所述氨基酸序列依次由SEQNO1、SEQNO2和SEQNO3编码。本专利技术的另一实施方案提供一种制备上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：以菌株Acinetobacter.tandoiiSC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk33、ppk44和ppk73。上述PCR使用的引物与限制性内切酶如下：ppk33引物F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC，限制性内切酶NcoⅠR:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC，限制性内切酶XhoⅠppk44引物F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGA，限制性内切酶BamHⅠR:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC，限制性内切酶SalⅠppk73引物F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACG，限制性内切酶BamHⅠR:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG，限制性内切酶PstⅠ本专利技术的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk33中的应用，其特征在于所述引物如下：F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATCR:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC。本专利技术的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk44中的应用，其特征在于所述引物如下：F:TGGATCCATGAATACGGCGGCACAGAR:TGTCGACTTATTTAATCATTTCCAACAAAGTC。本专利技术的另一实施方案提供如下一对引物在制备多聚磷酸盐激酶基因ppk73中的应用，其特征在于所述引物如下：F:TGGATCCTTGTCAATTTTAGATTTTAATTTACGR:TCTGCAGTTACTTTATAACGCTTAACAAAAAG。本专利技术的另一实施方案提供三种大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌分别为BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T。本专利技术的另一实施方案提供上述三种工程菌在污水除磷中的应用。本专利技术的另一实施方案提供上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73在制备上述工程菌BL21(DE3)/pET28a-ppk33T、M15/pQE30a-ppk73T、M15/pQE30a-ppk44T中的应用。本专利技术的大概方案如下：为进一步解析菌株SC36的除磷机制，采用IlluminaHiseq2000测序技术完成高效聚磷菌株Acinetobacter.tandoiiSC36的基因组扫描测序，构建300bp文库，利用SOAPdenovov2.04拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果后，再运用GapCloserv1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。依据拼接序列的总长、scaffold的数量以及scaffoldN50等技术指标，对多个Kmer的组装结果进行综合评定，最终SC36基因组测序分析获得了56个scaffold，GC含量为41.98％。利用Glimmer3.02软件进行细菌的基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与Nr、genes、string和G本文档来自技高网...

【技术保护点】
三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、ppk73的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73，其特征在于ppk33、ppk44、ppk73的DNA序列分别具有如SEQNO1、SEQNO2和SEQNO3所示的核苷酸序列。2.三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQNO4、SEQNO5、SEQNO6所示的氨基酸序列。3.权利要求2所述的三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于分别由SEQNO1、SEQNO2和SEQNO3所示的核苷酸序列编码。4.三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk33、ppk44、ppk73的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：以菌株Acinetobacter.tandoiiSC36基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk33、ppk44和ppk73。5.权利要求4所述的方法，其特征在于PCR使用的引物与限制性内切酶如下：ppk33引物F:CCATGGAAAATTTTCAACATTCATC，限制性内切酶NcoⅠR:GCTCGAGGATTTTCTGTAGACTCTTGTTCATC，限...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锐萍，张文飞，伍思宇，张起畅，殷浩能，吴红萍，金映虹，
申请(专利权)人：海南师范大学，
类型：发明
国别省市：海南,46