诱导锁阳种子愈伤组织的方法及其专用培养基技术

本发明专利技术公开了一种诱导锁阳种子愈伤组织的方法及其专用培养基。该诱导锁阳种子愈伤组织的培养基，是在Ｂ↓［５］培养基中添加如下添加物得到的培养基；所述添加物包括２，４－二氯苯氧乙酸（２，４－Ｄ）、激动素（ＫＴ）和赤霉素（ＧＡ↓［３］）。为了提高愈伤组织的诱导效率，所述添加物还可包括酪氨酸，其终浓度为２ｇ.Ｌ↑［－１］以下。本发明专利技术创造性地利用热处理对锁阳种子的激活作用以及激素２，４－Ｄ、ＫＴ和ＧＡ↓［３］的协同作用，打破种子的休眠并克服锁阳种子萌发对寄主的依赖性，从而得到了锁阳种子愈伤组织，而且锁阳种子愈伤组织的诱导率可高达１０％－２０％。采用本发明专利技术方法诱导形成愈伤组织的时间一般为３０天左右。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物组织^培养方法以及专门用于植物组织培养的培养基，尤 其是一种诱导锁阳种子愈伤组织的方法以及一种专门用于诱导锁阳种子愈伤组织 的培养基。
技术介绍
通过植物组织培养技术生产次生代谢产物是兼顾野生植物资源保护与资源开 发的有效途径。目前该技术在紫草、人参根、青蒿、毛地黄等药材的有效成分生产 中得到广泛应用，但对于药用寄生植物的研究尚不深入且仅限于肉苁蓉的组织培养。锁阳是全寄生植物，其寄主是白刺。锁阳种子的萌发机理具有一定的特殊性。 锁阳的种子具有一个发育不完全的球形原胚，需要长达数月至数年的休眠期以完成 后成熟过程(苏格尔等，1999.锁阳(6)770/K^/"历5W^aricMz R叩r.)的寄生生物 学特性及其人工繁殖.内蒙古大学学报-自然科学版.30(2) :214-218)，并且这种 球形原胚在感受到寄主白刺根分泌的化学识别物质后才能被刺激萌发，形成初生吸 器(芽管状器官)及次生吸器，并与白刺建立起寄生关系。锁阳是全寄生植物且种胚发育不完全，组织培养的关键是打破其对寄主的依赖 性，这一过程对激素的种类及其用量要求较严格，需要广泛筛选激素的种类及其配 比。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导锁阳种子愈伤组织的方法及其专用培养基。 本专利技术所提供的诱导锁阳种子愈伤组织的培养基，是在Bs培养基中添加如下添加物得到的培养基；所述添加物包括2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D)、激动素(KT)和赤霉素(GA3)。为了提高愈伤组织的诱导效率，所述添加物还可包括酪氨酸，其终浓度为2g丄—1 以下。当然，诱导锁阳种子愈伤组织的培养基也可为是在Bs培养基中添加如下添加物 得到的培养基；所述添加物为2,4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D)、激动素(KT)、赤霉素(GA3)和酪氨酸。所述B5培养基为植物组织培养中常用的基本培养基。其中，所述2， 4-二氯苯氧乙酸的终浓度可为0.4-5 mg'L/1 ，如1-3 mgl-1 ， 1-2 mg.L";所述激动素的终浓度可为0.2-2.5 mgl"，如0.5-2.0 mg'L";所述赤霉素的终 浓度可为0.4-5 mg.1/1，如1-2 m^L"。所述诱导锁阳种子愈伤组织的培养基是固体培养基。本专利技术所提供的诱导锁阳种子愈伤组织的方法，包括如下步骤1)将锁阳种 子进行热处理；2)将经步骤1)处理后的锁阳种子接种到上述任一种的诱导锁阳种 子愈伤组织的培养基上进行培养，得到锁阳种子愈伤组织。'该方法中，所述热处理的温度可为30-70'C，所述热处理的时间可为20-100分钟。该方法中的培养温度可为15-25°C。所述步骤2)还包括在接种前去掉锁阳种子果皮的步骤。本专利技术的专利技术人研究发现，高温处理对锁阳种子有强烈的刺激作用，即植物细 胞处于热休克时，植物会暂时合成一些新的蛋白质，成为热休克蛋白；热休克蛋白 可能会刺激植物内一些酶的产生，诱导相关生长激素的活性，从而诱导愈伤组织的 形成。本专利技术创造性地利用热处理对锁阳种子的激活作用以及激素2， 4-D、 KT和GA3 的协同作用，打破种子的休眠并克服锁阳种子萌发对寄主的依赖性，从而得到了锁 阳种子愈伤组织，而且锁阳种子愈伤组织的诱导率可高达10%-20%。采用本专利技术方 法诱导形成愈伤组织的时间一般为30天左右。本专利技术的方法有效提高了锁阳种子愈伤组织发生率，并为通过种子愈伤组织分 化吸器、从而进行寄生生物学研究提供了平台，同时也为以后的次生代谢产物生产 奠定了基础。 附图说明图1为实施例5的愈伤组织生长10天的图片(X4) 图2为实施例5的愈伤组织生长15天的图片(X4)具体实施例方式下述实施例中采用的Bs液体培养基的组成如表1所示，在其中加入琼脂即可得到Bs固体培养基:表lB5液体培养基的组成组成成分数量(mg/1)组成成分(mg/1)KN032500CoCl2 6H200. 025CaCl2 2H20150Na2—EDTA37. 3MgS04 7H20250FeS04 7H2027. 8NaH2P04 H20150蔗糖20(NH4) 2S04134pH5. 5-6. 0KI0. 75烟酸1. 0謂33. 0盐酸吡眵醇1.0MnS04 H2010肌醇100ZnS04 7H202.0盐酸硫胺素10Na2Mo04 . 2H200. 25CuS04 5H200. 025实施例1、锁阳种子愈伤组织的诱导将锁阳种子(苏格尔等，1999.锁阳(C7"0历ari鹏w/2卵n'c咖R卯r.)的寄生 生物学特性及其人工繁殖.内蒙古大学学报-自然科学版.30(2) :214-218)(内蒙 古大学)在3(TC处理90分钟，砂纸磨去果皮，然后转入0.1%体积百分含量的升汞 中消毒7分钟，无菌水冲洗5次，接种到愈伤组织诱导培养基中，18。C暗培养。培 养第30天，种子膨胀，愈伤组织开始形成。愈伤组织纯白色，生长迅速，5天后体 积约为种子体积的2-3倍；10天左右愈伤组织开始变褐色，生长减缓。实验设三次 重复，每次重复处理100粒种子。培养40天统计的愈伤组织发生率(愈伤组织发 生率=形成愈伤组织的种子数/处理的种子数)为13%±0.8%。上述愈伤组织诱导培养基是在B5固体培养基中添加如下添加物得到的培养基 2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D)、激动素(KT)、赤霉素(GA3)和酪氨酸；其中，2, 4-D 的终浓度为5 mgl—1、 KT的终浓度为2.5 mgl—1 、 GA3的终浓度为3 mgl"和酪 氨酸的终浓度为0.5 g1—1。实施例2、锁阳种子愈伤组织的诱导将锁阳种子(苏格尔等，1999.锁阳(OT 咖ori咖s朋卵r化咖Rupr.)的寄生 生物学特性及其人工繁殖.内蒙古大学学报-自然科学版.30(2) :214-218)(内蒙 古大学)在3(TC处理100分钟，砂纸磨去果皮，然后转入0.1%体积百分含量的升汞中消毒7分钟，无菌水冲洗5次，接种到愈伤组织诱导培养基中，15t:暗培养。 培养第25天，种子膨胀，愈伤组织开始形成。愈伤组织纯白色，生长迅速，5天后 体积约为种子体积的2-3倍；IO天左右愈伤组织开始变褐色，生长减缓。实验设三 次重复，每次重复处理100粒种子。培养40天统计的愈伤组织发生率(愈伤组织 发生率二形成愈伤组织的种子数/处理的种子数)为10%±1%。上述愈伤组织诱导培养基是在B5固体培养基中添加如下添加物得到的培养基 2，4-二氯苯氧乙酸(2， 4-D)、激动素(KT)、赤霉素(GA3)和酪氨酸；其中，2， 4-D 的终浓度为0.4mg.L'1、 KT的终浓度为0.2mg.L—1 、 GA3的终浓度为5 mg.！/1和酪 氨酸的终浓度为lg，L—1。实施例3、锁阳种子愈伤组织的诱导将锁阳种子(苏格尔等，1999.锁阳(6y/70，ri咖s朋卵Wc鹏Rupr.)的寄生 生物学特性及其人工繁殖.内蒙古大学学报-自然科学版.30(2) :214-218)(内蒙 古大学)在40 r处理60分钟，砂纸磨去果皮，然后转入0.1%体积百分含量的升 汞中消毒7分钟，无菌水冲洗5次，接种到愈伤组织诱导培养基中，2(TC暗培养。 培养第27天，种子膨胀，愈伤组织开始形成。愈伤组织纯白色，生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导锁阳种子愈伤组织的培养基，是在Ｂ↓［５］培养基中添加如下添加物得到的培养基；所述添加物包括２，４－二氯苯氧乙酸、激动素和赤霉素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贵林，岳鑫，任良玉，靳尚武，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：15[中国|内蒙]