本发明专利技术涉及一种表位组合物、其制备方法及用途，尤其是一种抗动脉粥样硬化的表位组合物、其制备方法和用途，属于生物药学技术领域。本发明专利技术的表位组合物包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白６５中１５个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位。其有益效果是：通过组合多个ｍＨＳＰ６５分子中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，使得到的表位组合物能够充分发挥类似全ｍＨＳＰ６５分子的免疫功效；同时由于仅选择使用具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位而避免使用全分子，减少了对其他自身免疫疾病的影响，避免了潜在的副作用；避免了由全ｍＨＳＰ６５分子自身的蛋白酶活性带来的降解问题，使工艺更加稳定和可行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表位组合物、其制备方法及用途，尤其是一种抗动脉粥样 硬化的表位组合物、其制备方法和用途，属于生物药学
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis)是一种严重危害人类健康的常见疾病， 近年来在我国的发病率呈现逐年增加的趋势。目前动脉粥样硬化已不再被简单 地认定为是大中型动脉壁脂质沉积的结果，而是一种由脂质代谢异常、血液凝 固失调以及与遗传、环境、微生物感染等因素有关的血管慢性炎症共同造成的 疾病过程。在人类动脉粥样硬化各阶段的病变中都观察到淋巴细胞、炎症因子 的参与，随着其相关自身抗原的鉴定，动脉粥样硬化已被归属为自身免疫性疾 病范畴。热休克蛋白(heat shock protein, HSP ) 65/60是动脉粥样硬化的主要自 身免疫抗原之一，在临床患者和实验模型动物的体内都可以检测到抗HSP65/60 的抗体。HSP65/60属于热休克蛋白60家族，是一类高度保守的蛋白分子，微生 物源的HSP65和哺乳动物源的HSP60在蛋白序列上的同源性可达50-60%，菌源 HSP65分子之间更可高达90%。正是由于这种高度的保守性使得两者之间存在明 显的交叉反应，当某些微生物感染机体时，针对微生物HSP65的免疫应答可能 因为该交叉反应而错误识别机体血管内皮组织表达的HSP60,对自身组织加以攻 击，从而启动或加速了动脉粥样硬化的过程。黏膜给予自身抗原诱发免疫耐受是预防自身免疫性疾病的有效途径。已有 研究证实，黏膜给予牛结核分枝杆菌(^""""r/咖6w/z2e)热休克蛋白65密度脂蛋白受体基因敲除小鼠的动脉粥样硬化程度, 但是应用mHSP65全分子作为预防动脉粥样硬化的疫苗存在一些缺点和顾虑首 先，mHSP65不仅仅是动脉粥样硬化的自身抗原，它同时还是多种其他的自身免 疫疾病的自身抗原，例如I型糖尿病、白塞氏病、实验性脑脊髓炎等等。mHSP65 分子中的不同表位可能和不同的自身免疫疾病相关。由于不同自身免疫疾病的 发病机理不一，且自身抗原在不同免疫条件下对疾病产生的效果也可能截然不 同，因此在利用mHSP65全分子免疫预防动脉粥样硬化的同时有可能对其他自身 免疫疾病产生不利影响，需要大量的实验来评估其安全性；其次，mHSP65分子 具有蛋白酶的催化活性，在制备过程中很容易被自身蛋白酶活性所分解，其制 备条件要求较高，不容易建立稳定简便的生产工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提出一种抗动脉粥样硬化的表位 组合物，替代完整mHSP65分子起到预防动脉粥样硬化的作用。本专利技术的另一个目的是提供制备抗动脉粥样硬化的表位组合物的方法。本专利技术的再一个目的是提供抗动脉粥样硬化的表位组合物在制备抗动脉粥样硬化的药物中的用途。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的 一种抗动脉粥样硬化的表位组 合物，包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白65中15个具有动脉粥样硬化自身免疫 抗原特征的表位，所述表位的氨基酸序列如下(1) Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Pro-Val-Lys-Val-Thr-Arg-Ser-Ala-Leu-Gln-Asn-A1a-A1a-Ser-I1e—A1a-G1y-Leu-Phe-Leuj(2) Leu-Glu-Asp-Pro-Tyr-Glu-Lys-Ile-Gly-Ala-Glu-Leu-Val;(3) A1a-Thr-Va1-Leu-A1a-G1n-A1a-Leu-Va1-Arg-G1u-G1y-Leu;(4) G1u-A1a-Thr-G1y-A1a-Asn-11e-Va1-Lys-Va1-A1a-Leu-G1u-A1 a-Pro-Leu-Lys-Gln;(5) IIe-A1 a-G1u-A1a -Me t-A s p-Ly s-Va1-G1y-A s n-G1u-G1y-Va1 -IIe-Th r-Va1-Glu-Glu;(6) Asp-Pro-Tyr-Ile-Leu-Leu-Val-Ser-Ser-Lys-Val-Ser-Thr-Val"Lys-Aspj(7) Glu-Gly-Glu-Ala-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Val-Asn-Lys-Ile-Arg-Gly-Thr;(8) Va1-A1a-G1y-G1y-G1y-Va1-Thr-Leu-Leu-G1n-A1a-A1 a-Pro-Thr-Leu-Asp-GluHLeu-Lys-L/eu-Glu-Gly-Asp;(9) Ala-Thr-VaKeu-Ala-Gln-Ala-Leu-Val-Arg-Glu-Gly-Leu-Arg-Asn5(10) Va1-A1a-A1a-G1y-A1 a-Asn-Pro-Leu-G1y-Leu-Lys-Arg-G1y-11e-G1u-Lys-Ala-Val-Glu-Lys;(11) Leu-Ser-Leu-Leu-Gly-Lys-Ala-Arg-Lys-Val-Val-Val-Thr-Lys-Asp5(12) Asn-Thr-Phe-G1y-Leu-G1n-Leu-G1u-Leu-Thr-G1u-G1y;(13) Gly-Pro-Lys-Gly-Arg-Asn-Val-Val-Leu-Glu-Lys-Lys-Trp-Gly-Ala-Pro;(14) Va1-A1a-G1y-G iy-G1y-Va1-Thr-Leu-Leu-G1n-A1 a-A1a-Pro-Thr;(15) Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys-Leu-Glu-Gly-Asp;其中，所述表位组 合物含有氨基酸序列为(1) ~ (15)中的至少l个表位。 本专利技术中抗动脉粥样硬化的表位组合物的制备方法由以下技术方案实现(a) 提取表位步骤将mHSP65中具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的1 ~ 15 个表位分成I -V组，每组中表位的总氨基酸个数《75个；(b) 构建重组质粒步骤将霍乱霉素B亚基(CTB)的DNA序列插入pET78a质 粒中，得到重组质粒pET28a-CTB，再分别将每组各个表位的DNA序列串联 插入重组质粒pET28a-CTB中CTB的DNA序列下游，得到表达各融合蛋白的I ~ V个重组质粒；(c) 以包涵体形式表达融合蛋白步骤在37i:下培养含有表达融合蛋白的重组 质粒的重组基因工程菌，用终浓度为3~15mmol/L的a-乳糖诱导表达融 合蛋白；(d) 分离纯化融合蛋白步骤将所述重组基因工程菌的菌体裂解后离心收集含 有融合蛋白的包涵体沉淀、用包涵体洗涤液和0.5-2mol/L尿素溶液洗去 部分杂质、再用6-8mol/L尿素溶液变性溶解包涵体、透析复性后经离子 交换柱层析纯化，得到纯化后的I V种融合蛋白；(e) 制备表位组合物步骤将纯化后的I ~ V种融合蛋白按摩尔比l: 1混合 后，用6-8mol/L尿素溶液进行变性处理，再经透析复性后冻干，得到抗 动脉粥样硬化的表位组合物。本专利技术的抗动脉粥样硬化的表位组合物在制备抗动脉粥样硬化的药物中的用途，是采用黏膜方式给药，诱使机体重新建立对这些表位的免疫耐受，从而 抑制了可能发生的自身免疫攻击，最终预防动脉粥样硬化或减轻动脉粥样硬化 的病变程度。本专利技术的有益效果是通过组合多个mHSP6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗动脉粥样硬化的表位组合物，包括牛结核分枝杆菌热休克蛋白６５中１５个具有动脉粥样硬化自身免疫抗原特征的表位，所述表位的氨基酸序列如下： （１）Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ； （２）Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ； （ ３）Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ； （４）Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ －Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ； （５）Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ； （６）Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌ ｅｕ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ； （７）Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ； （８ ）Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ； （９）Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｓｎ； （１０）Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ－ Ｇｌｕ－Ｌｙｓ； （１１）Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ； （１２）Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ； （１３）Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘景晶，熊祺琰，王华倩，孙云霄，贾绍辉，邓双玲，曹荣月，李泰明，金亮，吴洁，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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