一种白细胞介素２（ＩＬ－２）－白细胞介素６（ＩＬ－６）－白细胞介素２３（ＩＬ－２３）三聚体蛋白，提供一种生物技术来制备该三聚体蛋白及其在高效抗肿瘤方面的应用。通过ＲＴ－ＰＣＲ合成ＩＬ－２、ＩＬ－６及ＩＬ－２３ ｃＤＮＡ，经过纯化扩增酶切，将两者连接重组至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。该重组质粒的表达产物为ＩＬ－２－ＩＬ－６－ＩＬ－２３三聚体蛋白。其包含的三种细胞因子有较好的协同效应，抗肿瘤作用显著增强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种白细胞介素2 (IL-2) —白细胞介素6 (IL-6) —白细胞介素23 (IL-23)三聚体蛋白，提供--种生物技术来制备该三聚体蛋白，本专利技术的另一目的是提供IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白在高效抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
以往研究表明IL-2是由T细胞分泌的一种细胞因子，具有广泛的免疫活性，临床应用可使30%的淋巴瘤、肾癌、黑色素瘤病员有效。对结肠癌及非何杰金氏淋巴病也有较好疗效，而且能够增强免疫力。IL-6是一具有明显抗肿瘤活性的生物免疫调节剂，属参与造血、免疫的多功能因子，其特点是抗肿瘤活性高，毒性作用小。新近研究证实，IL-6可直接作用于M细胞，并促进其功能分化。IL-23是由p19和IL-12的p40亚单位通过二硫键相连组成的异二聚体。由活化的树突状细胞(DC)和巨噬细胞(M(p)产生，它能促进DC对肿瘤抗原肽的提呈，能影响T细胞的增殖，并且除了直接作用于T细胞外，IL-23还能通过DC来活化和调节T细胞依赖的免疫应答。最重要的是，IL-23具有较强的抗肿瘤作用，其对APC有明显激活作用。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白，提供一种生物技术制备IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白的方法。本专利技术的另一目的是提供一种IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白在高效抗肿瘤方面的应用。本专利技术的目的是通过下述方法实现的我们以IL-2功能区特异性的上下游引物，通过KT-PCR合成包含信号肽序列及HindIII-Kpn I两个酶切位点的IL-2 cDNA，以IL-6功能区特异性的上下游引物合成包含Bamffl-EcoRI两个酶切位点的IL-6 cDNA。以IL-23功能区特异性的上下游引物合成包含Xhol-Xbal两个酶切位点及终止密码子TGA的IL-23 cDNA。经过纯化酶切，分别连接重组至表达载体pcDNA3.1(+)。将该pcDNA3.1(+)/IL-2-IL-6-IL-23重组质粒转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达，表达产物即为IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白。IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白三种细胞因子有较好的协同效应，其抗肿瘤作用显著增强。具体实施例方式以下对本专利技术作详细说明一、 引物合成利用Sequce程序通过计算机分析确定转译的最佳起始区域，使其具有最小自由能，最佳碱基排列，确保两个引物之间，引物与模板之间具有最少的配对以避免扩增不必要的序列。在IL-2上游引物中导入HindIII酶切位点，接着为起始密码子ATG及信号肽序列；在下游引物中导入KpnI酶切位点。在IL-6上游引物中导入BamHI酶切位点，下游引物中导入EcoRI酶切位点。在IL-23上游引物中导入XhoI酶切位点；下游引物中导入终止密码子TGA及XbaI酶切位点。二、 基因克隆通过RT-PCR合成包含信号肽序列及HindIII-Kpn I两个酶切位点的IL-2 cDNA;无信号肽序列的包含Bamffl-EcoRI两个酶切位点的IL-6 cDNA及有终止密码子TGA的包含Xhol-Xbal两个酶切位点的IL-23 cDNA。经过纯化，再以T-A克隆进行扩增，最后将该L-2 cDNA、 IL-6 cDNA与IL-23 cDNA分别克隆入pcDNA3.1(+)表达载体，以HindIII-Kpn I 、 BamHI-EcoRI及Xhol-Xbal双酶切鉴定及测序分析。三、 真核细胞表达将上述阳性克隆转染CHO细胞表达，收集表达上清，以ELISA检测IL-2、 IL-6和IL-23蛋白的表达。四、 纯化及活性鉴定对表达上清进行蛋白纯化，纯化后的蛋白进行淋巴细胞增殖试验，证实该表达产物可明显增强淋巴细胞增殖，且比单独的IL-2、 IL-6及IL-23效果更为明显。该专利技术所获得的IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白有明显的协同效应，其抗肿瘤效果显著增强，且制备方法简单。权利要求1、一种白细胞介素2—白细胞介素6—白细胞介素23(IL-2-IL-6-IL-23)的三聚体蛋白，其特征在于由白细胞介素2、白细胞介素6与白细胞介素23多肽序列组成。2、 如权利要求l所述的三聚体蛋白，其特征在于IL-2cDNA含起始密码子、信号肽序列 和双酶切位点。3、 加权利要求l所述的三聚体蛋白，其特征在于IL-6cDNA含双酶切位点。4、 如权利要求l所述的三聚体蛋白，其特征在于DL-23含双酶切位点及终止密码子。5、 一种白细胞介素2—白细胞介素6—白细胞介素23三聚体蛋白的制备方法，其特征在 于IL-2、 IL-6及IL-23基因的克隆；三聚体蛋白的表达、纯化及活性鉴定。6、 如权利要求l所述的三聚体蛋白，其特征在于在免疫调节及抗肿瘤方面的应用。全文摘要一种白细胞介素2(IL-2)-白细胞介素6(IL-6)-白细胞介素23(IL-23)三聚体蛋白，提供一种生物技术来制备该三聚体蛋白及其在高效抗肿瘤方面的应用。通过RT-PCR合成IL-2、IL-6及IL-23 cDNA，经过纯化扩增酶切，将两者连接重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)。该重组质粒的表达产物为IL-2-IL-6-IL-23三聚体蛋白。其包含的三种细胞因子有较好的协同效应，抗肿瘤作用显著增强。文档编号C07K14/435GK101469018SQ20071017323公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日专利技术者峰 李 申请人:上海汇康生物科技有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白细胞介素２－白细胞介素６－白细胞介素２３（ＩＬ－２－ＩＬ－６－ＩＬ－２３）的三聚体蛋白，其特征在于由白细胞介素２、白细胞介素６与白细胞介素２３多肽序列组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，
申请(专利权)人：上海汇康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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