用解脂亚罗威阿酵母转化株表达和分泌异源蛋白质制造技术

解脂亚罗威阿（ＹＡＲＲＯＷＩＡ＿＿ＬＩＰＯＬＹＴＩＣＡ）的ＸＰＲ２和ＬＥＵ２基因顺序的排列，重组体解脂亚罗威阿无性繁殖的载体，包括编码表达哺乳动物蛋白质和其他多肽的异源ＤＮＡ；用ＸＰＲ２基因启动子，碱性蛋白质前源区和ＸＰＲ２终止密码子区等整合表达载体，能够在已转化的解脂亚罗威阿的细胞培养物中表达和分泌细胞外异源蛋白质；解脂亚罗威阿转化株包括所述的载体和质粒；并提供制备载体的方法．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酵母蛋白的分泌技术，尤其涉及重组解脂亚罗威阿酵母(Yarrowia lipolytica)克隆载体，包括为哺乳动物蛋白质(例如凝乳酶原)和其他多肽的表达和分泌的异源DNA编码;涉及表达载体，包括解脂亚罗威阿酵母基因启动子(例如XPR2或LEU2)、碱性蛋白酶信号(或前顺序、前区域、XPR2终止密码子区域，以及由于遗传密码简并性或使用其它解脂亚罗威阿酵母基因成分产生的变异体及其功能相同者。此外，本专利技术还涉及携带所述表达载体和分泌载体的酵母转化株，他们被用于产生天然功能状态的异源蛋白质;以及完成上述的各项方法。稳定而又充分地提供对工业(例如凝乳酶原、牛生长激素)或医用(例如尿抑胃激素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、人体过敏毒素C5a)有着重要价值的各种蛋白质或多肽，特别是提供可以作为易于获得的有作用的优质产品的原料，这种经济上的诱惑力，导致许多专利技术者把DNA重组体技术应用于作为生产异源蛋白质“工厂”的微生物。由于从重组体宿主细胞的胞内积累中特别是从大肠杆菌中重新获得具有生物活性的外源的或异源的(外来的)蛋白质存在着有可能解决困难的方法，所以进一步的研究集中在蛋白质的分泌上。在大肠杆菌中，异源蛋白质往往是以可折射光的包涵体的状态在细胞内产生的。该蛋白质通常水溶性很低，而且很少有或者没有生物活性。从可折射光的包涵体中提取该蛋白质通常包括苛刻的化学处理，这种处理可能花费昂贵而重新获得所需的天然的有生物活性的蛋白质都是微乎其微或者一无所获。此外，该蛋白质带有由大肠杆菌产生的不希望要的物质，为了释放可折射光的包涵体，需要破坏细胞，因而污染的可能性也随之剧烈增加。除了大肠杆菌外，其它微生物也能产生不溶性胞内状态的异源蛋白质，例如1982年7月28日公布的英国专利2，091，271号，公开了用DNA重组体技术表达牛犊凝乳酶的啤酒酵母(S.cerevisiae)的遗传修饰，凝乳酶的两个英文术语rennin和Chmosin可以交换使用。鉴于这些困难，从宿主微生物分泌该种蛋白质已转向力图产生具有天然活性构型的蛋白质。一种特殊的蛋白质，包括异源蛋白质或多肽是否可由特定的微生物分泌，看来似乎决定于蛋白质。在大多数真核细胞中，有的蛋白质合成装置是与内质网膜和在初生多肽链的氨基端附近的氨基酸顺序(称为“信号顺序”)有关，该链的作用是操纵蛋白穿过内质网膜。接着在提供具有活性的成熟的蛋白质的分泌过程中，用水解蛋白质切开信号顺序。已经做出的某些尝试，目的是为了包括枯草杆菌、啤酒酵母和培养中的哺乳动物细胞，用微生物中的信号顺序，发展分泌异源蛋白质的方法。然而所述的这些微生物尚未证明是合乎理想的。枯草杆菌的固有特性，例如分泌许多蛋白质，包括趋于会分解已被分泌的异源蛋白质的许多蛋白酶;已被转化的菌株由于失去异源DNA而造成不稳定性也阻碍了它的产生。从遗传学角度已经成功地完成了哺乳动物细胞表达和分离异源蛋白质，但是，这些系统都有技术上的要求，并且费用很高，要把大多数蛋白质作为产品进行商业生产仍然是不切实际的。虽然啤酒酵母作为蛋白质分泌系统有其某些固有的局限性，但另一方面，蛋白质分泌研究在啤酒酵母上取得的成功都超过枯草杆菌。1984年10月31日公布的欧州专利申请0123544号，介绍了啤酒酵母α因子基因的分离，并且将启动子和/或其信号肽部分与编码异源蛋白质的DNA相结合，应用到酵母的质粒上，使酵母细胞在细胞培养基上能够产生成熟的单一蛋白质。1983年9月14日公布的欧洲专利申请0088632号，介绍了表达和分泌啤酒酵母异源蛋白质的方法。可是啤酒酵母以这些或另一些分泌系统进行有效分泌的这些蛋白质的大小看来似乎限于20，000道尔顿左右。克服啤酒酵母作为分泌微生物的这种普遍性的低效率正如Smith等所介绍的，要求多重突变体(Science 229;1219～1224(1985))。对这种趋向的一个例外就是研究大于20000道尔顿的曲霉属(Aspergillus)酶类，看来这类酶可以用啤酒酵母分泌，但是被其强烈糖基化，这可能影响分泌的效率。特殊的兴趣是对解脂亚罗威阿酵母，一种用来产生柠檬酸和单细胞蛋白质的工业上重要的酵母菌种，也可用于产生赤鲜糖醇、甘露糖醇和异丙基苹果酸与啤酒酵母相反，解脂亚罗威阿酵母由于能够有效地把高分子量蛋白质(碱性蛋白酶，酸性蛋白酶和核糖核酸酶)分泌到生长培养基中，由此有可能回收天然状态的异源蛋白质而无需破坏产生的细胞，所以特别令人感到兴趣并具有特殊的意义。此外，解脂亚罗威阿酵母还能分泌很少量的几种蛋白质，因而有可能在生长培养基中产生所需要的占优势的蛋白质种类的异源蛋白质，并且简化回收所述的异源蛋白质产物。解脂亚罗威阿酵母产生高水平的胞外蛋白酶，这是由解脂亚罗威阿酵母分泌的占优势的蛋白质。特殊的蛋白酶(碱性的酸性的或中性的)取决于所用的解脂亚罗威阿酵母菌株(Ogrydziak等，J.Gen.Micro-biol.(1982)128，1225～1234)。碱性胞外蛋白酶的N-末端氨基酸顺序的部分顺序分析Ogrydziak等人已作了报导(loc.cit)。1984年7月25日提交的共同未决定专利申请634，505号，介绍了通过突变互补作用转化解脂亚罗威阿酵母和克隆解脂亚罗威阿酵母基因的方法，公开了通过解脂亚罗威阿酵母的XPr2突变的互补作用，克隆被分泌碱性蛋白酶编码的XPR2基因。该方法包括通过载体PLD40用BglⅡ部分消化解脂亚罗威阿酵母基因库来转化解脂亚罗威阿酵母的宿主菌株，已在1985年4月24日分布的欧洲专利申请0138508号即类似于上述已被鉴定的美国专利申请中作了介绍。本专利技术提供制备载体的方法，这类载体在被引入解脂亚罗威阿酵母宿主时，使宿主能够把产生分泌由异源DNA编码的特殊蛋白质于培养基中，这类异源DNA可以来自任何来源，但特别是来自真核生物的DNA和人工合成DNA;提供重组体解脂亚罗威阿酵母克隆载体，包括编码表达哺乳动物蛋白质和其他多肽的异源DNA，其中也有适合解脂亚罗威阿酵母宿主转化的质粒;特别提供整合表达载体，包括LEU2基因启动子，XPR2基因启动子，碱性蛋白酶早期前区域和XPR2终止密码子;表达具有异源编码顺序的质粒，这种密码顺序带有LEU2启动子的XPR2分泌信号下游该信号能表达和分泌以转化的解脂亚罗威阿酵母中的异源蛋白质。本专利技术用图解说明成熟异源蛋白质的表达和分泌，特别是从遗传学上已经改变的解脂亚罗威阿酵母细胞培养的凝乳酶原和人体过敏毒素C5a的表达和分泌。精确鉴定解脂亚罗威阿酵母细胞外碱性蛋白酶氨基酸顺序和DNA顺序的发现就有可能确定，异源蛋白质可以通过重组DNA技术来表达和分泌，以供细胞培养生产。就凝乳酶原而言，可以用成熟的酶原(凝乳酶的前体)来表达和分泌。现在已经发现解脂亚罗威阿酵母通过重组DNA技术可以从遗传上进行改变，使产生的转化株能够表达和分泌天然状态的异源蛋白质。这种改变可通过构建携带XPR2基因信号或信号和第一顺序(prol)或两个顺序(pro1+pro2)的载体来完成，XPR2基因是与需要分泌的异源蛋白质的结构基因顺序相连接的。通过在DNA载体的XPR2位点上的整合产生的转化株，包括失去调节的XPR2基因或不再产生碱性蛋白酶的基因两端的结构成分的片段，和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过解脂亚罗威阿酵母培养菌，产生和分泌异源蛋白质的方法，包括：①将表达载体引入所述的解脂亚罗威阿酵母中，表达载体包括编码异源于所述解脂亚罗威阿酵母、解脂亚罗威阿酵母基因或解脂亚罗威阿酵母启动子、解脂亚罗威阿酵母基因的信号和转录终止密 码子ＤＮＡ顺序的蛋白质的ＤＮＡ顺序。②将所产生的①的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养；和③回收异源蛋白质。

【技术特征摘要】
US 1985-10-18 789206;US 1986-3-18 8411211.一种通过解脂亚罗威阿酵母培养菌，产生和分泌异源蛋白质的方法，包括①将表达载体引入所述的解脂亚罗威阿酵母中，表达载体包括编码异源于所述解脂亚罗威阿酵母、解脂亚罗威阿酵母基因或解脂亚罗威阿酵母启动子、解脂亚罗威阿酵母基因的信号和转录终止密码子DNA顺序的蛋白质的DNA顺序。②将所产生的①的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养；和③回收异源蛋白质。2.一种通过解脂亚罗威阿酵母培养菌，产生异源蛋白质的方法，包括①将表达载体引入所述解脂亚罗威阿酵母，表达载体包括与解脂亚罗威阿酵母异源的蛋白质的DNA编码和至少下述之一的表达载体;LEU2基因及其启动子或终止密码子顺序、XPR2基因、启动子、信号、prol-、pro2-或XPR2基因的终止密码子顺序;②将所产生的①的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养;和③回收该异源蛋白质。3.根据权利要求2所述方法，其中所述基因是XPR2基因或LEU2基因。4.根据权利要求3所述方法，其中所述异源蛋白质DNA顺序是凝乳酶原或人体过敏毒素C5a顺序。5.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC-20780鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。6.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20779鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。7.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20778鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。8.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20777鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。9.根据权利要求3所述的方法，其中异源蛋白质基因被插在XPR2基因的启动子和终止密码子顺序之间。10.根据权利要求7所述的方法，其中异源蛋白质的基因是凝乳酶原或人体过敏毒素C5a基因。11.一种制造不产生碱性蛋白酶的解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括用XPR表达结构转化解脂亚罗威阿酵母的XPR+菌株。12.一种检测具有在XPR2基因上整合的载体DNA的解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括①用XPR表达结构转化解脂亚罗威阿酵母的XPR+菌株;②筛选在失去碱性蛋白酶活性①中产生的转化株。13.根据权利要求12所述方法，其中XPR+解脂亚罗威阿酵母菌株是用未切割的质粒PLS-3DNA或用Sna BⅠ消化的pls-3DNA转化的。14.根据权利要求12所述方法，其中所述解脂亚罗威阿酵母具有解脂亚罗威阿酵母ATCC20688鉴别特征。15.制备解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括将表达载体整合到含有与异源载体DNA同系区的解脂亚罗威阿酵母转化株，所述同系区包括在所述解脂亚罗...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰斯史蒂文维多酄，约翰罗伯特德齐，阿瑟欧内斯特弗兰克，
申请(专利权)人：美国辉瑞有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]