用清蛋白聚合的血清亲合结合法纯化乙型肝炎表面抗原前-Ｓ-区制造技术

重组体前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ通过快速有效两步层析法纯化。破碎表达重组体前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ的酵母细胞，澄清细胞内含物，用聚合人类血清清蛋白亲合层析分离该内含物，前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ进一步用丁基琼脂糖疏水反应层析纯化。这一过程得到高于９０％纯度的前－Ｓ－ＨＢｓＡｇ。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纯化酵母表达的重组体前-S-Hepatitis B表面抗原(HBsAg，前S-肝炎B)的一种快速有效方法。已证实该表面抗原肝炎B前-S区是病毒受体位点，在肝炎B病毒进入肝细胞之前，该区结合于肝细胞，Valenzuela et al，Bio/Technology 3∶317-320(1985)，该前-S区结合于聚合的血清清蛋白，认为聚合的血清清蛋白与肝细胞膜有关，因此，含有前-S的，衍生的重组体抗原被称作可诱导抗体的一类抗原，这些抗体能阻断肝炎B病毒与感受性宿主细胞的接触。肝炎B病毒含有前-S的表面抗原已从感染的人类血浆中分离得到，Neurath and Strick，Arch.Virol 6079-81(1979)，最近并用Valenznela，supra描述的标准重组体技术得到。事实上，Neurath和Strick能采用与人类聚合的血清清蛋白选择性结合的方法从HBeAg阳性人类血清中分离小量HBsAg。该HBsAg可用3M硫氰酸钠从连接了聚合的人类血清清蛋白的琼脂糖柱上洗脱。以此方法得到了25倍到80倍纯化血清HBsAg。然而，这一程序不能纯化重组体衍生的前-S(2)HBsAg。重组体前-S-HBsAg用快速有效两步层析方法纯化。破裂表达重组体前-S-HBsAg的酵母细胞，澄清该细胞内含物并用聚合的人类血清清蛋白亲合层析法分离。该前-S-HBsAg可用丁基琼脂糖疏水作用亲合层析进一步纯化。这种方法得到高于90%纯度的前-S-HBsAg。因此，本专利技术目的之一是提供一有效方法以纯化重组体衍生前-S-HBsAg。另一目的是提供一种方法，其允许快速，高纯度高产率重获前-S-HBsAg。本专利技术的这些目的和其它目的可从下文叙述中看出。本专利技术涉及一快速两步方法从酵母细胞溶胞产物中分离前-S抗原，在这种酵母细胞中该肽段是用重组体技术产生的。当下列叙述和实例描述与前-S(2)-HBsAg相关的本专利技术时，应明了本专利技术适用于任何含有与肝炎B表面抗原-S区相关的肽段的蛋白质。实例包括重组体衍生的前-S(1)S(2)-HBsAg，及未与肝炎B病毒表面抗原S区共价结合的前-S(1)S(2)和前-S(2)多肽。表达前-S(2)HBsAg的重组体酵母用Valenzuela et al。叙述的标准重组技术得到，Bio/Technology，3317-320(1985)，表达前-S(2)-HBsAg的酵母细胞用Carty et al方法生长，Eighty-Fourth ASM Meeting p.194，1984，收集这些细胞，离心并重悬于含约0.1M磷酸钠，约PH7.2，0.5MNacl的高渗缓冲液，浓度约50%(Wt/wt)，贮于-70℃。细胞在约20-23℃时融解，离心并重悬于Breaking缓冲液，其中含约0.1M HEPES，PH7.5，补充有0.01M EDTA，1μg/ml抑胃肽，0.13单位/ml aprotinin0.01M苯胺-盐酸及2mM苯基-甲烷，磺酸(PMSF)。该混合物1-7次通过Stansted压机以破裂细胞。破裂细胞浆液通过离心8，000xg 45分钟4℃而澄清。澄清的酵母提取物加入-含有偶联了聚合的人类血清清蛋白(PHSA)的Sepharose4B柱。人类血清清蛋白是按Machi-da et al，Gastroent 85268-274(1983)叙述的方法用戊二醛聚合的，按厂家要求偶联于CNBr-激活的Sepharose 4B。用一合适洗脱液洗，用含50mMHEPES PH7.5和0.5N Nacl的缓冲液A洗，然后将酵母提取液上柱。合适洗脱液包括碱金属的一，二或三卤代醋酸盐。碱金属指锂钠，钾，其中钠最为常用。卤素指氟，氯，溴和碘，其中氯最常用。因此，最常用为三氯醋酸钠。当所有样品进入柱子，不被吸收的蛋白质就用缓冲液A从柱中洗掉。吸收的前-S(2)-HBsAg用三氯醋酸钠水溶液从PHSA Sepharose柱中洗掉，三氯醋酸钠浓度1M-3.5M，最好用3M，PH6-8，最好用PH7。PHSA亲合分离得到80倍富集的前-S(2)-HBsAg。聚丙烯酰胺凝胶蛋白质转移和银染证明所分离的组分为前-S(2)-HBsAg，纯度至少为50%。该前-S(2)-HBsAg进一步用丁基Sepharose(Pharmacia)层析纯化。特别纯化了的前-S(2)-HBsAg对50mM3-(N-吗啉)丙烷磺酸(MOPS)PH7.0透析，泵入丁基Sepharose 4B柱，冲洗该柱，用约0.1% triton x-100，50mM MOPS，PH7.0将结合的前-S(2)-HBsAg洗脱，聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质转移和银染证明洗脱出的前-S(2)-HBsAg组分纯度大于90%。以下各例用于说明本专利技术，但不是对本专利技术的限制。例1用聚合的人类血清清蛋白亲合层析纯化前-(S)-HBsAg表达前-S(2)-HBsAg的重组体衍生酵母用Valen-zuela et al，Bio/Technology 3317-320，1985，所述标准组技术得到，细胞用Cartyetal，Eighty-Fourth ASM Metting，1984，Abstr 030，P194，所述方法生长，浓缩富集，对磷酸盐缓冲液PH7.2透析过滤，离心收集细胞，重悬于高渗缓冲液(0.1M磷酸钠，PH7.2，0.5M NaCl)，以-50%细胞悬液(Wt/wt)贮于-70℃。非特别指明，所有工作均在4℃完成、冰冻细胞悬浮液于20℃融解，至浆液具有半融稠度。细胞悬浮液转移至一已事先称重的离心瓶中，搅动至全部融解。于8000xg离心45分钟收集细胞。细胞154gm(湿重)与250ml破碎缓冲液(0.1M HEPES，PH7.5，0.01MEDTA，1μS/ml抑胃肽A，0.13 units/ml aprotinin，0.01M苯胺盐酸，2mM PMSF)混合准备裂解，细胞均匀分布然后通过-Stansted压机，80每平方吋克，10-12每平方吋克回压。破碎重复四次，8000xg离心45分钟收集上清液。人类血清清蛋白用戊二醛聚合，如Machida et al，Gas-troentero，85268-74，1983，所述，根据厂家指导偶联于CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)。制备聚合人类血清清蛋白(PHSA)结合Sepharose柱，床体积64ml，用300ml3M三氯醋酸钠PH7洗，再用700ml缓冲液A洗，缓冲液A含有50mM HEPES，0.5M Nacl和PH7.5。澄清的酵母提取液440ml(含20，520mg蛋白质和129mg前-S(2)，HBsAg)被泵入PHSA Seph-arose柱，流速25ml/hour，全部样品进柱后，用缓冲液A洗去末被吸收的蛋白质。前-S(2)-HBsAg用3M三氯醋酸钠PH7洗脱，检测和纯度分析前-S(2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化重组体表达的肝炎Ｂ病素前—Ｓ表面抗原的方法，包括：ａ．将含前（２）的抗原连接于聚合的血清清蛋白母体入；ｂ．将该抗原从母体上洗脱，用卤代醋酸碱金属盐；及ｃ．用丁基琼脂糖亲合层析及一合适的洗脱剂进行最后纯化。

【技术特征摘要】
US 1986-4-25 8563251.一种纯化重组体表达的肝炎B病毒前-S表面抗原的方法，包括a.将含前(2)的抗原连接于聚合的血清清蛋白母体入；b.将该抗原从母体上洗脱，用卤代醋酸碱金属盐；及c.用丁基琼脂糖亲合层析及一合适的洗脱剂进行最后纯化。2.据权项1所述的方法，在步骤a中的清蛋白是人类或黑猩猩的血清清蛋白。3.据权项1所述的方法，在步骤a中的清蛋白是人类血清清蛋白。4.据权项1所述的方法，在步骤a中的抗原是前-S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)-HBsAg，前-S(1)S(2)或前-S(2)。5.据权项1所述的方法，在步骤b中的碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：E戴尔莱曼，特德F谢弗，威廉J麦卡里尔，
申请(专利权)人：默克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]