作为霍乱疫苗缺失突变体制造技术

本发明专利技术描述了一种不产毒遗传上稳定的霍乱弧菌突变体菌株的特征，该菌株缺少任何机能ａｔｔＲＳ１序列，可用作诱导抗霍乱的免疫保护的活口服疫苗，本发明专利技术还描述了制造该菌株的方法。本发明专利技术还描述了一种死的口服霍乱疫苗，该疫苗至少包括第一和第二种霍乱弧菌菌株，其中该菌株中至少一种是不同的血清型，并且该疫苗还含有该血清型中至少一种所产生的霍乱毒素Ｂ亚单位。本发明专利技术还有一个特色是载有异源抗原的霍乱弧菌疫苗。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的领域是霍乱弧菌疫苗。在对霍乱研究100多年以后，仍然需要一种有效的霍乱疫苗。已经发生过六次由属于“典型的”纯系群的霍乱弧菌菌株引起的这一疾病的世界性流行。当前(第七次)流行的病原属于“ElTor”纯系群(Finkelstein，Crit.Rev.Microbiol 2∶553-623，1973，Wachsmuth et al.，The Lancet 337∶1097-1098，1991)。当前，第七次大流行已蔓延到南非的新地域。始于1991年1月的在秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚和智利流行的霍乱导致250000多个病例和2000人以上的死亡。在这次流行前，据估计每年主要在印度、孟加拉国、非洲和西亚发生200000以上霍乱病例(Tacket et al.，Cholera Vaccines.In Vaccines∶New Approachestk Immunological Problems，Ellis，R.W.，editor，Butterworth-Heinemann，Boston，1992)。在1992年11月，一种抗原上特殊的，非01型霍乱弧菌在印度和孟加接国出现并在八个月内造成估计500000个病例和6000例死亡。这种被命名为血清组0139，同物异名为“Bengal”的新菌株的大流行的潜势看来是肯定的。这些新近的试验强调了需要抗由ElTor 01和非01血清型霍乱弧菌引起疾病的有效霍乱疫苗。由于霍乱的自然感染及因霍乱恢复诱导出至少持续三年的免疫性(Tacket et al.，同上文;Levine et al.，J.Infect.Dis.143∶818-820，1981;Cash et al.，J.Infect.Dis.130∶325-333，1974)，已进行了许多科研努力以制备活的、减毒的霍乱疫苗，这些疫苗在口服时在其免疫接种性能方面模拟该疾病，但不会在免疫个体中引起有害的症状或反应(即呈现低的基因活性)。这一类型的疫苗涉及缺失突变，这些突变使将霍乱毒素的A亚单位的基因，即一种造成在这一疾病中所见腹泻的主要原因的蛋白失活(Mekalanos et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79∶151-155，1982;Mekalanos et al.，Nature 306∶551-557，1983;Kaper et al.，Nature 308∶655-658，1984;Kaper et al.，Biotechnology 2∶345，1984;Pierce et al.，Infect Immun.55∶477-481，1987;Taylor et al.，Vaccine 6∶151-154，1988;Levine et al.，Infn.Immun.56∶161-167，1988;Herrington et al.，J.Exper.Med.168∶1487-1492，1988;Levine et al.，Lancet 11∶467-470，1988;Kapper et al.，Res.Microbiol.141∶901-906，1990;Pearson et al.，Res Microbicl.141∶893-899;1990)。还可参看Mekalanos的美国专利5，098，998和4，882，278以及Kaper等人的美国专利4，935，364，这些专利经参阅已纳入本文。这些涉及霍乱疫苗的主要争论点是安全性、稳定性及它们抗原性的程度。关于霍乱弧菌的毒素基因，Chen等人已测定了产毒和非产毒菌株中的遗传多样性(1991，Epidemiol.Infect.107∶225)。Mekalnos(1983，Cell 35∶253)就霍乱弧菌毒菌基因的复制和放大问题提出了报告，Miller等人(1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶3471)讨论了该毒素基因的转汞调节。其产物是可以在这一生物的致病性方面起作用的其他霍乱弧菌基因包括毒素共调节菌毛基因(Shawet al.，1990，Infect.Immun.58∶3042;Sharma et al.，1989，Vaccine，7∶451;Sun et al.，1990，J，Infect.Dis.161∶1231;Hall et al.，1991，Infect.Immun.59∶2508;Taylor et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2833)，以及将肠集群因子编码的基因(Taylor et al.，1988，Vaccine 6∶151)。本专利技术以一种不产毒的，遗传上稳定的霍乱弧菌突变体菌株为特征，该菌株作为诱导对霍乱免疫保护的活的、口服疫苗是有效的。该突变体菌株是一种缺少使机能ctxA亚单位的编码的DNA以及也缺少任何机能attRS1序列的遗传工程的突变体。attRS1序列是指在需要重组和放大CTX遗传要素的CTX遗传要素范围内所含的17个碱基对序列，或能足以使这样的重组和放大实现的该种序列。“缺少任何机能attRS1序列”的突变体是那些基本上不能经受与含attRS1载体有效的位点特定重组的突变体，因为野生型attRS1序列是完全缺失的或充分缺失或突变的从而阻碍这种重组。因此，本专利技术的霍乱弧菌菌株更为安全，因为它们不能与含有包括ctxA编码DNA的野生型attRS1载体重组。本专利技术还以制备上述霍乱弧菌菌株的方法为特点。该方法包括将一种质粒引入野生型霍乱弧菌中，该质粒含有在ctxA和attRS1序列中包含着突变的霍乱弧菌DNA的片段。该霍乱弧菌DNA片段是能与野生型霍乱弧菌DNA在机体内重组而产生突变体菌株的。尽管可使用任何血清型霍乱弧菌疫苗，但在较佳实施方案中，该霍乱弧菌突变体菌株属于El Tor纯系群，更佳的是属于Inaba或Ogawa血清型或霍乱弧菌非01纯系群，较佳的是0139“Bangal”血清型。较佳的是，该突变体缺少全部CTX核心和at-tRS1序列，更佳的是，该突变体菌株是如下所述的Peru-2、Bang-2、Bah-2或Beng的减毒衍生物。本专利技术的突变体菌株任选地可包括为改进疫苗的安全性和/或免疫原性而引入的另外突变。这些另外的突变包括，但不是限于，被该菌株编码的recA基因的失活，以及将补充基因引入霍乱弧菌染色体，较佳的是引入霍乱弧菌lacZ基因。这些补充基因包括将霍乱弧菌的B亚单位或任何异源抗原，如Shiga类毒素B亚单位编码的基因，或一种将E.coli CFA抗原编码的基因。异源抗原是指通常不被霍乱弧菌所表达的任何抗原。例如，该异源抗原可以是Shiga类毒素、Shigella脂多糖(LPS)抗原、E.coli菌毛抗原，或可以在霍乱弧菌活疫苗中被表达的HIV抗原。后面提供了可用于构建异源疫苗的另外抗原的补充实施例。较佳的是，具有补充突变的该突变体菌株是Peru-3、Peru-4、Peru-5、Bang-3、Bang-5、Bah-3、Bah-4、Bah-5或Beng的一种减毒衍生物。ctxA亚单位是指霍乱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不产毒遗传稳定的霍乱弧菌突变体菌株，所述菌株是缺少将机能ｃｔｘＡ亚单位编码的ＤＮＡ的遗传工程缺失突变体，所述突变体还缺少任何机能ａｔｔＲＳ１序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JJ米卡兰诺斯，D贝蒂，K基利恩，吕亦晨，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，病毒研究院，
类型：发明
国别省市：US[美国]