基因转移的修饰蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术涉及制备包含核酸的蛋白质的方法，包括：在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并具有包含核酸能力的高分子物质反应，以在欲氨酰胺残基的γ－位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键以及核酸包含物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及缀合物I)可与人体细胞的特异性受体结合的生物活性肽或蛋白质，和II)对核酸、尤其是DNA具有亲和力，并且有包含核酸能力的高分子物质，以及制备所说缀合物的方法。此缀合物可与具有特异性受体的细胞结合，并可将缀合物中包含的核酸转移到细胞中。另外，本专利技术涉及用于基因治疗的缀合物，其中基因可被转移至人体的特异型细胞，特异性器官或肿瘤细胞。已知大量具有生物活性的肽或蛋白质，它们在下文中也被称作“生物活性肽”。它们的例子是从自然界中得到的生物活性肽，例如在人体中显示出生理作用的肽，如白细胞介素(IL))—1，—2，—3，—4，—5，—6，—7，—8，—9，—10，—11和—12，G—CSF，GM CSF，M—CSF，促红细胞生成素，干细胞生长因子(SCF)，mp1—配体，α—，β—和γ—干扰素，促生长素抑制素、加压素、胰岛素、生长激素和P物质；通过修饰上述肽而得到的肽；从动物中衍生的物质，如铃蟾肽；从微生物中衍生的物质，如白喉毒素；从植物中衍生的物质，如凝集素。抗体也是生物活性肽，抗体不仅包括人的单克隆抗体也包括动物的单克隆抗体。大多数生物活性肽可与相应受体特异性地结合以激活它们的生理功能，抗体可与相应抗原特异性地结合。可溶的受体包括人体中存在的受体以及通过基因重组方法人工制备的受体。这些可溶受体象人体膜受体一样可与配体特异性地结合。据认为通过使用上述特异性的结合可将特异的生物活性肽用作靶分子。例如，已尝试用以下方法，其中白喉毒素与IL—6分子结合，并特异性地运送至具有IL—6受体的肿瘤细胞，因而可杀死肿瘤细胞。另外，将抗肿瘤剂结合到可识别癌症特异性抗原的单克隆抗体上以将抗肿瘤剂特异运送至肿瘤细胞的方法也发展成有效的方法。另外，在药物传送系统(DOS)中使用生物活性肽的方法在基因治疗领域也很重要。George Y.Wu等人已开发出基因治疗，其中聚赖氨酸(带正电荷)通过化学方法与生物活性肽，如脱唾液酸血清类粘蛋白结合，此缀合物包含DNA质粒(带负电荷)以将DNA运送到具有脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞中(J.Biol.Chem.，236，14621，1988)。通过静脉内注射，此缀合物可将此基因转移至肝中，它很有希望成为有效的基因传送系统。所要治疗的疾病要依靠被传送的基因。在基因治疗的一种方法中，病毒的胸苷激酶基因被转移至肝中，通过胸苷激酶被激活的抗病毒药物9—(1，3—二羟—2—丙氧甲基)鸟嘌呤也被转移，此抗病毒药物只在肝中被激活，因而病毒疾病治疗所产生的副作用较小。当核酸被施用于人体以进行基因治疗时，此核酸快速地被酶降解，否则DNA不能轻易进入细胞。另外，在此基因治疗中，当基因插入基因组时，对一些插入部分而言细胞是不匹配的，或者说通过转移基因表达的物质有时与细胞不相匹配。所以，以下情况是必需的。I)在核酸不被降解的条件下将核酸运送至细胞。II)核酸以高速转移至细胞。和核酸尽可能多地被转移至需要治疗的特异性细胞中。针对上述问题的一个解决方案是使用一些聚合物来包裹核酸以抑制核酸的降解。另一个方法是将与细胞上特异性受体结合的配体与核酸包含物联合，通过配体—受体结合，由细胞内吞作用将核酸转移至特异型细胞中，在这种情况下，有必要将包含有核酸的聚合物与作为配体的生物活性肽结合。通常，当生物活性肽通过化学反应与修饰聚合物结合时，它们的生物活性趋于不相匹配，并通过不同的副反应形成了副产品，使得难于维持所产生的药物的质量。此药物需要保持不变的高质量水平。有必要开发一种实用的方法，其中具有包含核酸能力的高分子物质在适度的条件下可与生物活性肽特异地结合，而且在此方法中副反应也应该可以避免。本专利技术涉及制备包含核酸的蛋白质的方法，它包括在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并且有包含核酸能力的高分子物质反应，在谷氨酰胺残基的γ—位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键。本专利技术涉及生物活性肽或蛋白质的缀合物，如白细胞介素—6和白细胞介素—2，以及具有包含基因能力的高分子物质，如聚赖氨酸。本专利技术涉及含有生物活性肽或蛋白质的缀合物和具有包含基因能力的高分子物质以及核酸的核酸组合物。本专利技术也涉及用于基因转移治疗的药物组合物，它包括所说缀合物和药用可接受载体。本专利技术也涉及用于基因转移治疗的药物组合物，它包括所说核酸组合物和药用可接受载体。附图说明图1所示为聚赖氨酸和IL—6的反应溶液色谱图。图2所示为经纯化的与聚赖氨酸结合的IL—6色谱图。图3所示为IL—6和与聚赖氨酸结合的IL6体外活性结果。图4所示为与聚赖氨酸结合的IL—6和DNA组合物组成的电泳图。本专利技术人进行了许多研究以解决上述问题，结果发现在使用转谷氨酰胺酶的适度条件下，具有包含核酸能力的高分子物质可与生物活性肽结合。转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)(系名蛋白质—谷氨酰胺γ—谷氨酰基转移酶)是一已知酶，通过它，肽或蛋白质的谷氨酰胺残基可与具有氨基基团物质的氨基基团特异性地结合。在不同的文献中已报道了转谷氨酰胺酶，例如(a)J.E.Folk et al.，Adv.Protein Chem.31，1—133，1977(b)J.E.Folk et al.，Adv.Enzymol，38，109—191，1973(c)H.Bohn et al.，Mol.Cell Biochem.20，67—75，1978(d)L.Lorand et al.，Handbook of Biochemistry andMolecular Biology，Vol.2，Proteins，ed G.D.Fasman，pp.669—685，ClevelandCRC.3rd ed.(e)Guinea pig and rabbit liver transglutaminaseT.Abe etal.，Biochemistry，16，5495—5501(1977)(f)Human red blood cells transglutaminaseS.C.Brenner etal.，Biochem.Biophys.Acta.522，74—83，1978(g)Rat coagulating gland transglutaminaseJ.Wilson etal.，Fed.Proc.，38，1809(Abstr.)，(1979)根据tje起源已经知道不同种类的转谷氨酰胺酶。它们的例子包括衍生于微生物的转谷氨酰胺酶，和哺乳动物转谷氨酰胺酶，如肝转谷氨酰胺酶，血浆因子XIIIa，血小板和盘因子XIIIa，毛囊转谷氨酰胺酶，表皮转谷氨酰胺酶以及前列腺转谷氨酰胺酶。这些转谷氨酰胺酶中的任何一个都可用于本专利技术，优选的是BTG。在通过转谷氨酰胺酶结合中，反应只在特定位置处进行。因此，只形成很少几种副产物，此反应因而容易控制。另外由于酶解反应，在化学反应中可得到下列好处I)缀合物在特定位置处形成而不降低所结合物质功能的可能性很大。II)由于结合是在生理条件下进行的，所结合的物质不会变性。III)由于质量水平可以维持，则可以生成高质量的药物，产品可保持不变地具有独特的、限定结构。同时，通过基因互相联合的重组DNA方法可使蛋白质互相结合，与重组DNA方法相比，使用转谷氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备包含核酸的蛋白质的方法，包括：在转谷氨酰胺酶存在下，将具有至少一个谷氨酰胺残基的生物活性肽或蛋白质与含有氨基酸供体，并具有包含核酸能力的高分子物质反应，以在谷氨酰胺残基的γ－位置处的酰胺部位与氨基酸供体的氨基基团形成酰胺键。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高原义之，山田尚之，本木正雄，
申请(专利权)人：味之素株式会社，株式会社药物靶向输送系统研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]