本发明专利技术提供用于在宿主细胞中表达外源遗传物质的新型重组杆状病毒表达系统。这种表达系统可方便地应用于以高通量方式表达外源遗传物质的自动化方法。在其它方面，本发明专利技术阐述了用于通过采用本发明专利技术的重组杆状病毒表达系统传染至宿主中而测定外源遗传物质功能的新型自动化方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术的领域广义上，本专利技术涉及分子生物学和遗传学领域。具体地，本专利技术涉及用于通过转染昆虫细胞表达外源遗传物质的新型杆状病毒表达系统。杆状病毒感染昆虫细胞。原核细胞和真核细胞均已用于表达外源遗传物质。然而，只有当外源遗传物质的产物不需要翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化或信号肽切除时，原核细胞如大肠杆菌细胞才适合表达其基因产物。原核细胞不含有这种翻译后修饰所需的机构。因此，在真核细胞中开发新型易操作的重组表达系统尤为重要。杆状病毒感染的昆虫细胞可完成大多数真核细胞转录后修饰(包括磷酸化、N-和O-连接糖基化、乙酰化、二硫键交连、寡聚物组装和亚细胞定位)，并且其已被用于从多种外源基因制备功能性重组蛋白。遗传修饰的杆状病毒被广泛用于制备重组蛋白(Davies，Bio／technology 1247-50(1994))。典型杆状病毒包括但不限于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、Rachiplusia ou、Galleria mellonella和家蚕(Bombyx mori)。其中，可能苜蓿银纹夜蛾表征最全面且应用最广泛。在天然的病毒生活周期中杆状病毒的多角体蛋白以非常高的水平表达，而在细胞培养中又不是必需的。这就允许将其替换为几乎任何感兴趣的异源核苷酸序列。任何插入以替换多角体蛋白的异源核苷酸本身可由多角体蛋白启动子控制，并由此获得同样高水平的表达。杆状病毒基因组包含大约130kb DNA，对于常规质粒克隆技术来说太大而不易操作，因此对其进行分子水平的操作是具有挑战性的。传统解决该问题的方法是通过同源重组导入同时含有外源基因、合适启动子和终止序列的盒子。这通过在质粒载体上以病毒DNA序列从两侧包围该盒子来完成，该病毒DNA序列是待插入的病毒基因组位点的两侧序列。该方法的效率不到1％。在过去采用噬菌斑纯化由此产生克隆载体。一些传统程序参见Smith等，美国专利4，745，051；Smith等，美国专利4，879，236；Summers等，美国专利5，169，784；Guarino等，美国专利5，077，214；Kang等，美国专利5，194，376；Matsuura等，美国专利5，229，293和Murphy等，美国专利5，516，657，这些专利的公开以参考文献并入本文。然而最近已发展了几种不同技术增加重组至杆状病毒基因组的效率。下面描述那些最成功的方法。杆状病毒基因组已被重新构建成在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中增殖的复制子。这通过在杆状病毒基因组多角体蛋白位点插入一个酵母自主复制序列(ARS)，以及CEN(中心粒)序列(它作为有丝分裂着丝粒而确保病毒基因组以稳定的低拷贝数分离)和URA3筛选标记(以允许在无尿嘧啶培养基中生长)来实现。这样多角体蛋白启动子启动的外源基因的重组可被酵母接受，所产生的杆状病毒基因组可从酵母细胞中提取，并作为克隆载体直接转染至昆虫细胞中。该方法的优点包括接近100％的效率并能在外源宿主中操作那些其产物可能对昆虫细胞有毒的基因。然而，需要大量操作，使该方法繁重而复杂。杆状病毒基因组还可被重新构建成可在大肠杆菌(Escherichiacoli)中增殖的复制子。Luckow等(病毒学杂志(J．Virology)674566-4579)在一个与酵母所用方法相同的方法中首次描述了可将杆状病毒基因组修饰成一个大质粒在大肠杆菌中复制，称为“杆粒”。这可通过重组一个小F复制子(其赋予杆状病毒基因组自主复制和稳定低拷贝数分离的能力)至多角体蛋白位点，和插入一个kanr筛选标记来实现。还可导入Tn7细菌转座子的靶位点，作为pUC衍生质粒来源的lacZa序列中符合阅读框的插入片段。因此该杆粒可与大肠杆菌宿主如DH 1 OB的缺损β-半乳糖苷酶lacZDM15进行等位基因内互补。但含有在Tn7位点插入了外源基因的杆粒的大肠杆菌DH 1 OB将保持lacZaˉ，使含有重组杆粒的菌落能用视觉筛选。该程序的整个策略是在异源宿主(这里是大肠杆菌)中完成重组和筛选步骤，然后再将完成的产物转至昆虫细胞中。该策略具有酵母系统类似的优点，但也涉及很多步骤。除了在认为适于筛选重组体的异源宿主中重新构建杆状病毒复制子外，还发展了一种体外重组反应将基因从转移载体转至病毒的多角体蛋白位点。利用噬菌体Pi的Cre重组酶及其底物lovp，该系统的基因转移可通过单酶交换反应来实现。改造目标杆状病毒基因组(vaclox)和转移载体，使其均含有lox位点。该34个核苷酸序列指导Cre酶将两个底物DNA分子转换成拓扑结构上不相连的重组产物。在化学计量上该反应进行的效率约为70％，这种方法最大的优点是简便，但最大效率只有约70％。1990年，Kitts等(核酸研究(Nucl．Acids Res．)185667-5672(1990))通过在多角体蛋白位点引入单一限制性位点(Bsu36I)从以共价闭合环状双链分子存在的野生性杆状病毒DNA衍生了新的杆状病毒DNA。用这个酶切位点将杆状病毒基因组线性化，减少了病毒DNA转染至昆虫细胞的效率，但与驱动多角体蛋白位点重组的转移载体共转染，产生了高出3倍比例的重组病毒。在该策略中，含有Bsu36I位点的杆状病毒称为ACRP-SC(单酶切位点)，该策略还发生转移待表达的外源基因及其自身拷贝的多角体启动子和终止子序列的两个双交换事件。这种共转染产生的子代病毒约15％-25％是重组子，但应注意，这是由于野生型病毒背景降低引起的，而不是重组子绝对数目增加引起的。该系统的随后发展将它与(基于lacZ的)病毒筛选和基于复制的筛选策略有效地联合起来。见Kitts等“生物技术”(Biotechniques)14810-817(1993)。重组在传统转移载体和野生型基因组的衍生基因组(命名为BacPAK6)之间发生，该衍生基因组在多角体蛋白位点含有lacZ，在多角体蛋白侧翼序列还含有另外两个Bsu36I位点。用Bsu36I酶消化该杆状病毒DNA，不仅使该分子线性化，而且还除去了两个基因组片段，从而破坏了开放阅读框ORF-1629。该基因是杆状病毒所必需的，所以随着两个Bsu36I片段从基因组中去除，感受态病毒只能通过与转移载体重组来重建，由此基因组将恢复完整ORF-1629。而且在来自BacPAK6 DNA的蓝色噬菌斑背景上，重组病毒将形成白色噬菌斑。该策略产生重组病毒的频率为85％-99％。大部分背景是由于污染了未消化的BacPAK6 DNA，它比该基因组的线性化形式具有更高的感染性。对将来的工作有用的病毒可能是产生的病毒总数中一小部分，它们可用传统技术(噬菌斑实验)来纯化。因此这种方法将简便和高效很好的统一起来，将是我们将阵列cDNA转移至表达载体的所选方法。与杆状病毒表达系统有关的一个具体问题是它们会引起被感染细胞凋亡或裂解。杆状病毒细胞凋亡抗性基因(p35基因)已证明该抗性增加了某些细胞系的病毒产量。带有该基因的重组杆状病毒能在合适的宿主中选择性地扩增(达到106倍)。尽管杆状病毒表达系统相关的处理将高产和可靠性有用的统一起来，但从杆状病毒感染的细胞中纯化目标产物不比任何其它真核系统容易。已发本文档来自技高网...
【技术保护点】
含有至少一个筛选标记基因、启动子、转录终止序列和可操作接受外源遗传物质的克隆位点的杆状病毒表达系统。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：R克拉克，A戴维斯，
申请(专利权)人：昂尼克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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